Glykoxidation, arterielle Biomechanik und Zielorganschäden (GlycOxiTOD)

EINFÜHRUNG

Atherosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen (ASCVD) stellen eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in der Bevölkerung dar. Arterielle Hypertonie (AHT) prädisponiert zusammen mit anderen kardiovaskulären Risikofaktoren (CVR) zu Anomalien in der Struktur und Funktion großer und kleiner Arterien, die zu vorzeitiger Gefäßalterung führen und in der Entwicklung von Zielorganschäden (TOD) gipfeln, die sich wiederholen ein klarer, aber unterdiagnostizierter Vorläufer von ASCVD. Allerdings entwickeln nicht alle Patienten eine TOD, und dies auch nicht im gleichen Zeitraum oder mit der gleichen Intensität. Darüber hinaus wird davon ausgegangen, dass Patienten, die anfänglich eine niedrige bis mäßige CVR aufweisen, bei Vorliegen einer TOD bereits eine mäßige bis hohe CVR aufweisen und strengere therapeutische Ziele verfolgen [1,2].

Die Gefäßbiomechanik konzentriert sich hauptsächlich auf die Untersuchung der mechanischen Eigenschaften und des Verhaltens von Arterien. Eine ungünstige arterielle Biomechanik ist mit der Entstehung und dem Fortschreiten von Atherosklerose und Arteriosklerose verbunden. Diese Prozesse stellen ein Kontinuum von Gefäßschäden dar, die durch die Ansammlung oxidierter Lipoproteine ​​im subendothelialen Raum, die Aktivierung und Verstärkung von Entzündungswegen sowie die Entwicklung von arterieller Fibrose und Verkalkung vermittelt werden. Im Mittelpunkt dieser Phänomene steht das Auftreten einer endothelialen Dysfunktion, die durch eine erhöhte Permeabilität und einen Verlust der Filterkapazität des Gefäßendothels für schädliche Moleküle an der Arterienwand gekennzeichnet ist [3,4].

Oxidativer Stress, definiert als ein Ungleichgewicht zwischen der Produktion reaktiver Spezies und antioxidativen Systemen zugunsten ersterer, spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung einer endothelialen Dysfunktion, der Ablagerung oxidierter Lipoproteine ​​und der proinflammatorischen Wechselwirkung zwischen diesen und dem mononuklear-phagozytischen System. Die Anhäufung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und anderer führt zu Lipidperoxidations- und Glykoxidationsphänomenen, die in der Bildung fortgeschrittener Lipoxidations- und Glykationsendprodukte (ALEs bzw. AGEs) gipfeln. ALEs und AGEs können an Proteine ​​binden, was zu funktionellen und strukturellen Anomalien führt und auch die zelluläre Signalübertragung beeinflusst, indem sie unter anderem Todespfade aktiviert [5,6].

Ein ungünstiger Redoxstatus und ungünstige Glykationswerte sind bei bestimmten Subpopulationen, insbesondere bei Patienten mit Diabetes mellitus (DM), mit Alterung, degenerativen Erkrankungen und akkumulierten Gefäßschäden verbunden. Über den Einfluss der Glykation und Glykoxidation des Antioxidationssystems auf die arterielle Biomechanik und die Entwicklung von Zielorganschäden bei scheinbar gesunden Patienten mit mäßiger bis hoher CVR ist jedoch wenig bekannt. Unser Ziel ist es, die spezifische Beziehung zwischen arteriellen biomechanischen Anomalien und TOD mit den Serumglykationswerten, dem Glykoxidationsstatus und dem Funktions-Struktur-Gleichgewicht einiger antioxidativer Systemelemente zu untersuchen, wobei Katalase, Superoxiddismutase und Glutathionperoxidase hervorgehoben werden [4,7,8].

MATERIALEN UND METHODEN

Projektdesign und -einrichtung

Hierbei handelt es sich um ein beobachtendes, ambispektives und multizentrisches Projekt, das von der Abteilung für Bluthochdruck und kardiovaskuläres Risiko der Abteilung für Innere Medizin des Universitätskrankenhauses von Santiago de Compostela gefördert wird. Bei den Patientenkandidaten handelt es sich um Personen, die der Organisationsstruktur für Integriertes Management (EOXI) von Santiago de Compostela und Barbanza angehören und Beratung zur Diagnose, Behandlung und Nachsorge kardiovaskulärer Risiken suchen [9].

Teilnehmer. Einschluss und Ausschluss Kriterien

Aus dem Gesamtpool der konsultierten Patienten werden nur Personen über 18 Jahre mit einem moderaten bis hohen kardiovaskulären CVR-Risikoprofil basierend auf den Referenzwerten der Leitlinien vorab ausgewählt. Zu den Ausschlusskriterien gehören das Vorhandensein von DM gemäß den aktuellen Richtlinien für die klinische Praxis, Rauchgewohnheiten (definiert als aktueller Konsum und innerhalb der 6 Monate vor der Einstellung), riskanter Alkoholkonsum (definiert als Konsum von mehr als 10 g und 20 g täglich für Frauen und Männer). , bzw.) und etablierte Herz-Kreislauf-Erkrankungen [10–14].

Bewertung arterieller biomechanischer Marker und TOD

Wir werden eine bilaterale Ultraschalluntersuchung der Arteria carotis communis (CCA), der Arteria carotis interna (ICA) und der distalen Arterien der unteren Extremitäten mit einem Mindray Z60-Gerät (Mindray®, Guangdong, China) mit Hochfrequenzsonde durchführen. Die folgenden Messungen und Berechnungen werden extrahiert:

1. Im Bewegungsmodus (M-Modus) gleichzeitige Messung des Arterienradius, des Arteriendrucks und der Gesamtwanddicke zur Berechnung der Dehnbarkeits- und Spannungsparameter im mittleren Segment des CCA [15,16].
2. Im zweidimensionalen Modus (B-Modus) automatische Messung der Intima-Media-Dicke (IMT) im distalen Bereich des CCA, zusammen mit der Erkennung und Charakterisierung von Cholesterin-Plaque[17].
3. Im Spektral-Doppler-Modus morphologische Beschreibung der Volumen-Zeit-Funktion (Fluss) anhand von Strömungsgeschwindigkeiten und Gefäßwiderstandsindizes im mittleren Segment des CCA und ICA [18].
4. Im B-Modus mit Elastographiemodul direkte Auswertung des lokalen Steifigkeitsgrads in einem mittleren Segment des CCA [19].
5. Im Spektral-Doppler-Modus mit EKG-Synchronisation Beurteilung der Karotis-Femoral-Pulswellengeschwindigkeit (cf-PWV) [20].
6. Im Spektral-Doppler-Modus Beurteilung des Knöchel-Arm-Index (ABI) [21].

Wir werden auch beginnende Schäden im Mikrogefäßsystem der Netzhaut mittels Retinographie mit einem Topcon TRC-NW6S-Gerät (Electronics®, Tokio, Japan) beurteilen.

Bewertung von Markern für oxidativen Stress und der Aktivitätsstruktur des antioxidativen Systems

Zur Beurteilung des Redoxstatus werden die Niveaus der Lipidoxidation (Lipidperoxidation) und der Proteine ​​in Plasma und Urin durch Quantifizierung von Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS) bzw. reduzierten Thiolen gemäß den angegebenen Protokollen bestimmt [22,23]. Beide Methoden ermöglichen eine Quantifizierung über spektrophotometrische Methoden. Die Analysen werden mit einem Asys UVM-340-Analysegerät (Biochrom®, Cambridge, UK) durchgeführt. Die enzymatische Funktion von Glutathionperoxidase, Katalase und Superoxiddismutase wird als enzymatische Aktivität mit einem Asys UVM-340-Analysegerät (Biochrom®, Cambridge, UK) gemäß den angegebenen Protokollen gemessen [24,25]. Strukturmerkmale antioxidativer Enzyme basierend auf Glykations- und Glykoxidationsmustern werden mithilfe von Proteomik einschließlich SDS-PAGE, Chromatographie und Massenspektrometrie bewertet [26–28].

Bestimmung des Glykations- und Glykoxidationsstatus

Der Prozentsatz an glykiertem Hämoglobin wird mithilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit dem Hämoglobin-Next-Analysegerät (A. Menarini Diagnostics®, Florenz, Italien). Der Fructosaminspiegel wird durch die enzymatische Methode mit diazymglykiertem Serumprotein (Diazyme, Kent, UK) auf einem Advia 2400-Analysegerät (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.®, Tarrytown, USA) bestimmt. Der Prozentsatz an glykiertem Albumin wird anhand der Fructosamin- und Albuminspiegel geschätzt [29,30]. Diese Laboruntersuchung wird von der Laborabteilung des Zentralkrankenhauses durchgeführt.

Der allgemeine Grad der Glykoxidation wird durch Bestimmung fortgeschrittener Glykationsendprodukte (AGEs) in der Haut mithilfe eines AGE-Readers (DiagnOptics BV®, Groningen, Niederlande) quantifiziert. AGEs stellen hauptsächlich glykierte Addukte dar, die an Proteine ​​gebunden sind und bei Glykoxidationsprozessen entstehen. Der AGE Reader wurde entwickelt, um die Autofluoreszenz der Haut (SAF) nicht-invasiv anhand der Fluoreszenzeigenschaften verschiedener AGEs zu beurteilen [31].

Ergebnisse im kardiovaskulären Risiko

Wir werden die Anzahl der benötigten Behandlungstermine (Number Needed to Treat, NNT) der Konsultationen und die Untersuchungszeit messen, um Anomalien in der arteriellen Biomechanik und Zielorganschäden (TOD) zu erkennen, und so einen erhöhten CVR bestimmen, der eine Therapieintensivierung rechtfertigt. Kardiovaskuläre und zerebrovaskuläre Ereignisse, Krankenhauseinweisungen, Konsultationen, Tod und Behinderung werden ebenfalls bewertet [32].

Ethische Überlegungen und gute klinische Praxis

Diese Studie wird in Übereinstimmung mit den ethischen Grundsätzen der Deklaration von Helsinki und den Standards guter Praxis in der Forschung des galizischen (spanien) Gesundheitsdienstes (SERGAS) durchgeführt. Von allen Patienten, die einer Teilnahme zugestimmt haben, wird eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Die Protokolle wurden von der Forschungsethikkommission von Santiago-Lugo genehmigt (Codes 2021/401 und 2023/302).

Arbeitsplan und Projektablauf

In einer ersten Phase planen wir, Patienten einzubeziehen, die die Kriterien erfüllen und der Teilnahme zustimmen. Klinisch-anthropometrische Bewertung, arterielle Biomechanik, TOD-Erkennung und Probenentnahme werden in einem einzigen medizinischen Akt durchgeführt. Biomechanische, oxidative Stress-, Glykations- und Glykoxidationsmarker werden sowohl bei Patienten mit als auch ohne biomechanische Anomalien und arterielle TOD quantifiziert. Ziel dieser Phase ist es, die Unterschiede zwischen Patientengruppen anhand biomechanischer Parameter und arterieller TOD zu bewerten. In einer Untergruppe von Patienten werden auch Unterschiede in der Struktur-Funktion antioxidativer Enzyme im Hinblick auf Glykations- und Glykoxidationsniveaus sowie deren Zusammenhang mit arteriellen biomechanischen Anomalien und TOD untersucht. Diese Phase umfasst die Extraktion, Sammlung, Verarbeitung und Analyse vorläufiger Daten sowie die Erzielung erster Projektergebnisse.

In einer zweiten Phase

1. Patienten ohne biomechanische Anomalien oder TOD werden einer 5-Jahres-Nachuntersuchung unterzogen, mit jährlicher und abschließender Bewertung biomechanischer Anomalien, TOD und kardiovaskulärer Ergebnisse. Das Ziel dieser Phase besteht darin, Unterschiede in den vorherigen Markern zwischen Patientengruppen basierend auf biomechanischen Parametern und arteriellem TOD zu bewerten. In einer Untergruppe von Patienten werden auch Unterschiede in der Struktur-Funktion antioxidativer Enzyme im Hinblick auf Glykations- und Glykoxidationsniveaus sowie deren Zusammenhang mit arteriellen biomechanischen Anomalien und TOD untersucht. Diese Phase umfasst die Extraktion, Sammlung, Verarbeitung und Analyse vorläufiger Daten sowie die Erzielung der Endergebnisse des Projekts.
2. Patienten mit biomechanischen Anomalien und/oder TOD werden einer 5-Jahres-Nachuntersuchung mit jährlichen und abschließenden Bewertungen des TOD-Verlaufs und der kardiovaskulären Ergebnisse unterzogen. Das Ziel dieser Phase besteht darin, Unterschiede in den vorherigen Markern zwischen Patientengruppen basierend auf arteriellem TOD und kardiovaskulären Ergebnissen zu bewerten. In einer Untergruppe von Patienten werden Unterschiede in der Struktur-Funktion antioxidativer Enzyme im Hinblick auf Glykations- und Glykoxidationsniveaus sowie deren Zusammenhang mit TOD und kardiovaskulären Ergebnissen untersucht. Diese Phase umfasst die Extraktion, Sammlung, Verarbeitung und Analyse vorläufiger Daten sowie die Erzielung der Endergebnisse des Projekts.

Mathematische Analyse und Modellierung

Es wird das Statistiksoftwarepaket SPSS 22.0 (SPSS Inc.®, Chicago, IL, EE.UU) eingesetzt. Es wird ein deskriptiver statistischer Ansatz durchgeführt, einschließlich der Bewertung der Normalität für quantitative Variablen. Univariate Statistiken werden verwendet, um Gruppen mit spezifischen Tests je nach Variablentyp zu vergleichen. Wenn relevante Ergebnisse gefunden werden, werden lineare Korrelationsstudien durchgeführt. Nach der univariaten Analyse werden multivariate Modelle erstellt, die sowohl die Assoziation von Prädiktoren mit den Ergebnissen erklären als auch das Risiko biomechanischer Anomalien, TOD und kardiovaskulärer Ergebnisse vorhersagen. Um Faktoren zu bewerten, die biomechanische Parameter, TOD und kardiovaskuläre Ergebnisse im Laufe der Zeit beeinflussen können, werden spezifische mathematische Verfahren im Zusammenhang mit dem gemeinsamen Modellierungsansatz und der Zeitreihenanalyse angewendet. Berechnungen der Stichprobengröße basieren auf spezifischen statistischen Tests je nach Variablentyp und -verteilung, wobei stets eine moderate Effektgröße, ein 95 %-Konfidenzintervall (95 %-KI) und eine Trennschärfe von mindestens 80 % berücksichtigt werden [33–35].

VERWEISE

1. Wang MC, Lloyd-Jones DM. Kardiovaskuläre Risikobewertung bei Bluthochdruckpatienten. Am J Hypertens 2021;34:569-77. https://doi.org/10.1093/ajh/hpab021.
2. Piskorz D. Hypertensive vermittelte Organschäden und Hypertonie-Management. Wie lässt sich die positive Wirkung blutdrucksenkender Behandlungen beurteilen? Hoher Bluthochdruck, Kardiovaskulär, Prev 2020;27:9-17. https://doi.org/10.1007/s40292-020-00361-6.
3. Simon BR, Kaufmann MV, McAfee MA, Baldwin AL. Finite-Elemente-Modelle für die Arterienwandmechanik. J Biomech Eng 1993;115:489-96. https://doi.org/10.1115/1.2895529.
4. Guzik TJ, Touyz RM. Oxidativer Stress, Entzündung und Gefäßalterung bei Bluthochdruck. Hypertonie 2017;70:660-7. https://doi.org/10.1161/HYPERTENSIONAHA.117.07802.
5. Vistoli G, De Maddis D, Cipak A, Zarkovic N, Carini M, Aldini G. Fortgeschrittene Glykoxidations- und Lipoxidationsendprodukte (AGEs und ALEs): ein Überblick über ihre Bildungsmechanismen. Free Radic Res 2013;47 Suppl 1:3-27. https://doi.org/10.3109/10715762.2013.815348.
6. Gianazza E, Brioschi M, Fernandez AM, Banfi C. Lipoxidation bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Redox Biol 2019;23:101119. https://doi.org/10.1016/j.redox.2019.101119.
7. Al-Kuraishy HM, Sami OM, Hussain NR, Al-Gareeb AI. Metformin und/oder Vildagliptin lindern durch Diabetes mellitus Typ II verursachten oxidativen Stress: Die faszinierende Wirkung. J Adv Pharm Technol Res 2020;11:142-7. https://doi.org/10.4103/japtr.JAPTR_18_20.
8. Mattson MP. Rolle des Lipidperoxidationsprodukts 4-Hydroxynonenal bei Fettleibigkeit, dem metabolischen Syndrom und damit verbundenen vaskulären und neurodegenerativen Erkrankungen. Exp Gerontol 2009;44:625-33. https://doi.org/10.1016/j.exger.2009.07.003.
9. Hospital Clínico Universitario de Santiago – Área Sanitaria de Santiago de Compostela y Barbanza (Hospitales, Centros de Salud, Casas del Mar y Consultorios) n.d. https://xxisantiago.sergas.es/Paxinas/web.aspx?tipo=paxtab&idLista=3&idContido=183&migtab=174%3B183&idioma=es (abgerufen am 12. März 2024).
10. Visseren FLJ, Mach F, Smulders YM, Carballo D, Koskinas KC, Bäck M, et al. 2021 ESC-Leitlinien zur Prävention von Herz-Kreislauf-Erkrankungen in der klinischen Praxis. Eur Heart J 2021;42:3227-337. https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehab484.
11. Briasoulis A, Agarwal V, Messerli FH. Alkoholkonsum und das Risiko von Bluthochdruck bei Männern und Frauen: eine systematische Überprüfung und Metaanalyse. J Clin Hypertens (Greenwich) 2012;14:792-8. https://doi.org/10.1111/jch.12008.
12. Amos A, Greaves L, Nichter M, Bloch M. Frauen und Tabak: ein Aufruf zur Einbeziehung des Geschlechts in Forschung, Politik und Praxis zur Tabakkontrolle. Tabakkontrolle 2012;21:236-43. https://doi.org/10.1136/tobaccocontrol-2011-050280.
13. ElSayed NA, Aleppo G, Aroda VR, Bannuru RR, Brown FM, Bruemmer D, et al. 2. Klassifizierung und Diagnose von Diabetes: Versorgungsstandards bei Diabetes – 2023. Diabetesversorgung 2023;46:S19-40. https://doi.org/10.2337/dc23-S002.
14. Autoren/Task Force-Mitglieder: McDonagh TA, Metra M, Adamo M, Gardner RS, Baumbach A, et al. 2021 ESC-Leitlinien für die Diagnose und Behandlung von akuter und chronischer Herzinsuffizienz: Entwickelt von der Task Force für die Diagnose und Behandlung von akuter und chronischer Herzinsuffizienz der Europäischen Gesellschaft für Kardiologie (ESC). Mit besonderem Beitrag der Heart Failure Association (HFA) des ESC. Eur J Heart Fail 2022;24:4-131. https://doi.org/10.1002/ejhf.2333.
15. Bozkurt Yılmaz HE, Yılmaz M. Beurteilung der Dehnbarkeit und Elastizität der Halsschlagader bei Patienten mit Asthma. Iran J Allergy Asthma Immunol 2021;20:279-86. https://doi.org/10.18502/ijaai.v20i3.6329.
16. Kane JW, Sternheim MM. Física. Zurückkehren; 1989.
17. Molinari F, Zeng G, Suri JS. Ein aktueller Überblick über die Messung der Intima-Media-Dicke (IMT) und Wandsegmentierungstechniken für den Karotisultraschall. Computermethodenprogramme Biomed 2010;100:201-21. https://doi.org/10.1016/j.cmpb.2010.04.007.
18. Andrikou I, Tsioufis C, Konstantinidis D, Kasiakogias A, Dimitriadis K, Leontsinis I, et al. Nierenresistenzindex bei Bluthochdruckpatienten. J Clin Hypertens (Greenwich) 2018;20:1739-44. https://doi.org/10.1111/jch.13410.
19. Ultraschallelastographie: Überblick über Techniken und klinische Anwendungen – PubMed n.d. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28435467/ (abgerufen am 12. März 2024).
20. Ji H, Xiong J, Yu S, Chi C, Bai B, Teliewubai J, et al. Messung der Pulswellengeschwindigkeit von Karotis zu Femur (Cf-PWV) zur Beurteilung der arteriellen Steifheit. J Vis Exp 2018:57083. https://doi.org/10.3791/57083.
21. Zwakenberg SR, de Jong PA, Hendriks EJ, Westerink J, Spiering W, de Borst GJ, et al. Intimale und mediale Verkalkung im Zusammenhang mit kardiovaskulären Risikofaktoren. PLoS One 2020;15:e0235228. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235228.
22. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Test auf Lipidperoxide in tierischen Geweben durch Thiobarbitursäure-Reaktion. Anal Biochem 1979;95:351-8. https://doi.org/10.1016/0003-2697(79)90738-3.
23. Ellman GL. Sulfhydrylgruppen im Gewebe. Arch Biochem Biophys 1959;82:70-7. https://doi.org/10.1016/0003-9861(59)90090-6.
24. Aebi H. Katalase in vitro. Methoden Enzymol 1984;105:121-6. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(84)05016-3.
25. Flohé L, Günzler WA. Tests auf Glutathionperoxidase. Methoden Enzymol 1984;105:114-21. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(84)05015-1.
26. Kwas M, Bucholc B, Slusarczyk J. [Verwendung der Elektrophorese im Polyacrylomidgel (SDS_PAGE) zur Bewertung der IgG-Struktur – dem Hauptbestandteil des menschlichen intravenösen Immunglobulins]. Med Dosw Mikrobiol 2000;52:301-9.
27. Chaila MZ, Viniegra M, Gagliardino JJ, Martínez A, Simesen de Bielke MG, Frusti M, et al. Messung von glykiertem Hämoglobin: Vergleich von drei Methoden mit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. J Diabetes Sci Technol 2022;16:724-31. https://doi.org/10.1177/1932296821997179.
28. van Schaick G, Pot S, Schouten O, den Hartog J, Akeroyd M, van der Hoeven R, et al. Bewertung der Wirkung der Glykierung auf die Lipaseaktivität mittels Boronat-Affinitätschromatographie und Massenspektrometrie. Lebensmittelchemie 2023;421:136147. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2023.136147.
29. Hoelzel W, Weykamp C, Jeppsson J-O, Miedema K, Barr JR, Goodall I, et al. IFCC-Referenzsystem zur Messung von Hämoglobin A1c im menschlichen Blut und die nationalen Standardisierungsprogramme in den Vereinigten Staaten, Japan und Schweden: eine Methodenvergleichsstudie. Clin Chem 2004;50:166-74. https://doi.org/10.1373/clinchem.2003.024802.
30. Wu W-C, Ma W-Y, Wei J-N, Yu T-Y, Lin M-S, Shih S-R, et al. Serumglykiertes Albumin als Leitfaden für die Diagnose von Diabetes mellitus. PLoS One 2016;11:e0146780. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146780.
31. Atzeni IM, van de Zande SC, Westra J, Zwerver J, Smit AJ, Mulder DJ. Der AGE Reader: Eine nicht-invasive Methode zur Beurteilung langfristiger Gewebeschäden. Methoden 2022;203:533-41. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2021.02.016.
32. Wolff G, Lin Y, Akbulut C, Brockmeyer M, Parco C, Hoss A, et al. Metaanalysierte Zahlen, die zur Behandlung neuartiger Antidiabetika für kardiovaskuläre Ergebnisse benötigt werden. ESC Herzinsuffizienz 2023;10:552-67. https://doi.org/10.1002/ehf2.14213.
33. Diaz-Louzao C, Barrera-Lopez L, Lopez-Rodriguez M, Casar C, Vazquez-Agra N, Pernas-Pardavila H, et al. Längsschnittbeziehung der Leberschädigung mit Entzündungsbiomarkern bei hospitalisierten COVID-19-Patienten unter Verwendung eines gemeinsamen Modellierungsansatzes. Sci Rep 2022;12:5547. https://doi.org/10.1038/s41598-022-09290-x.
34. Malone HE, Nicholl H, Coyne I. Grundlagen der Schätzung der Stichprobengröße. Nurse Res 2016;23:21-5. https://doi.org/10.7748/nr.23.5.21.s5.
35. Cohen J. Statistische Leistungsanalyse für die Verhaltenswissenschaften. 2. Aufl. New York: Routledge; 1988. https://doi.org/10.4324/9780203771587.