Prenatální analýza cirkulující Fetální DNA bez buněk (APAFLC)

Cílem této studie je ověřit neinvazivní protokol pro extrakci a čištění CCFDNA ze vzorků mateřské krve a analýzu fetální DNA pomocí technologie MPS k vytvoření otcovství. Pro rozvoj této metodiky bude provedena předběžná studie pomocí vzorků krve od těhotných žen, jejichž identita partnerů je známa. LHML spolupracovala s týmem profesora Sentilhes v Bordeaux University Hospital Center, aby tyto vzorky získala.

Vzorky žilní krve (~ 10 ml) budou odebrány od těhotných žen mezi 6 a 22 týdny amenorea v trubicích CCFDNA v paxgenové krvi (Qiagen), aby se zabránilo degradaci DNA. Vzorky budou odstředěny na oddělení plazmy a ccfDNA bude izolována pomocí přístroje EZ2 Connect FX a soupravy EZ1 a 2 CCFDNA (Qiagen). Paralelně se budou shromažďovat bukální výtěry od matek a jejich partnerů jako referenčních vzorků, zpracované pomocí rutinních extrakčních protokolů LHML. Kromě toho bude se shromažďována a zpracovávána pupeční pupečnívá krev od novorozenců s interním protokolem pro získání purifikovaných extraktů DNA.

Tyto referenční vzorky nám umožní potvrdit profily dříve identifikované u těhotných žen a plodů, ale také ověřit analýzu filiace mezi plodem a jeho otcem. Všechny vzorky DNA budou kvantifikovány pomocí soupravy vyšetřovatele Quantiplex Pro (Qiagen) a PCR System Quantstudio 5 (Applied Biosystems).

CcfDNA z mateřské krve bude analyzován pomocí sekvenčního systému MISEQ FGX (Verogen), prvního nástroje NGS ověřeného pro forenzní genomiku. Bude použita souprava Verogen Foreenseq Mainstay, která zesiluje a sekvence 27 autozomálních STR, 25 let a amelogenin. Tento přístup zajišťuje spolehlivé profilování i z nízkých koncentrovaných vzorků CCFDNA s kapacitou až 96 knihoven na běh.

Referenční DNA z bukálních výtěrů a pupeční krve podstoupí MPS pomocí stejné soupravy Verogen Foresen Mainstay a bude křížově validována kapilární elektroforézou pomocí soupravy pro vyšetřovatele 24PLEX QS (Qiagen). Analýza dat bude provedena pomocí softwaru Foreenseq Universal Analysis a interním programem analýzy rodičovství vyvinutý LHML. Software Familias může být také použit pro výpočet poměrů pravděpodobnosti pro stanovení otcovství. Všechny systémy zpracování dat jsou offline pro zajištění důvěrnosti.

Tato otevřená prospektivní studie bude vyžadovat vzorky z 20 kompletních trojic (matka, otec, novorozence) a bude se zabývat dvěma hlavními kritickými body. Prvním cílem je stanovit prahovou hodnotu kvality genetických profilů získaných se soupravou na soupravu Verogen Foreenseq nezbytnou pro spolehlivou analýzu otcovství. To bude hodnoceno výpočtem procenta validovaných STR lokusů mezi 27 analyzovanými autozomálními STR. Druhým zaměřením je stanovit optimální množství CCFDNA potřebné k vytvoření genetického profilu pokrývajícího nejméně 20 autozomálních STR pomocí soupravy Verogen Foresen Mainstay. To bude zahrnovat kvantifikaci extraktů ccfDNA a korelaci těchto hodnot s objemem krve mateřského krve potřebným k získání dostatečné ccfDNA pro analýzu. Cílem této studie je nakonec rozšířit vědecké porozumění analýze CCFDNA u těhotných žen používajících technologii MPS a co je nejdůležitější, poskytovat kritickou podporu ženám, které otěhotní po sexuálním napadení tím, že jim umožňují potvrdit otcovství jejich plodu s jistotou, a zabývat se zásadním aspektem jejich psychologického uzdravení jejich psychologického uzdravení