Análisis prenatal de ADN fetal circulante sin células (APAFLC)

El objetivo de este estudio es validar un protocolo no invasivo para extraer y purificar el ADNc de las muestras de sangre materna y analizar el ADN fetal utilizando la tecnología MPS para establecer la paternidad. Para desarrollar esta metodología, se realizará un estudio preliminar utilizando muestras de sangre de mujeres embarazadas cuyas identidades de parejas son conocidas. LHML se ha asociado con el equipo del profesor Sentilhes en el Bordeaux University Hospital Center para obtener estas muestras.

Las muestras de sangre venosa (~ 10 ml) se recolectarán de mujeres embarazadas entre 6 y 22 semanas de amenorrea en tubos de ccfDNA de sangre paxgena (Qiagen) para prevenir la degradación del ADN. Las muestras se centrifugarán para separar el plasma, y ​​el CCFDNA se aislará utilizando el instrumento EZ2 Connect FX y el kit CCFDNA EZ1 y 2 (Qiagen). Paralelamente, se recolectarán hisopos bucales de las madres y sus parejas como muestras de referencia, procesadas utilizando los protocolos de extracción de ADN de rutina de LHML. Además, la sangre del cordón umbilical de los recién nacidos se recolectará y procesará con un protocolo interno para obtener extractos de ADN purificados.

Estas muestras de referencia nos permitirán confirmar los perfiles previamente identificados para las mujeres embarazadas y los fetos, pero también validar el análisis de filiación entre el feto y su padre. Todas las muestras de ADN se cuantificarán utilizando el investigador Quantiplex Pro Kit (Qiagen) y el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 5 (Applied Biosystems).

El ADNc de la sangre materna se analizará utilizando el sistema de secuenciación MISEQ FGX (VEROGEN), el primer instrumento NGS validado para la genómica forense. Se utilizará el kit de plávano de plávano de Forenseq Verogen, que amplifica y secuence 27 STR autosómicos, 25 Y-STRS y amelogenina. Este enfoque garantiza un perfil confiable incluso de muestras de ADNc de baja concentración, con capacidad para hasta 96 bibliotecas por ejecución.

El ADN de referencia de los hisopos bucales y la sangre umbilical se someterá a MP utilizando el mismo kit de plávano de Frayenseq verogénico y se validará cruzado con electroforesis capilar utilizando el kit QS de Investigator 24Plex (Qiagen). El análisis de datos se realizará con el software de análisis universal de FASEENSQ y un programa de análisis de parentesco interno desarrollado por LHML. El software Familias también puede usarse para calcular las relaciones de probabilidad para la determinación de la paternidad. Todos los sistemas de procesamiento de datos están fuera de línea para garantizar la confidencialidad.

Este estudio prospectivo abierto requerirá muestras de 20 tríadas completas (madre, padre, recién nacido) y abordará dos puntos críticos principales. El primer objetivo es determinar el umbral de calidad de los perfiles genéticos obtenidos con el kit de plávano de plano de Frasense de Verógeno necesario para un análisis de paternidad confiable. Esto se evaluará calculando el porcentaje de loci STR validados entre los 27 STR autosómicos analizados. El segundo enfoque es establecer la cantidad óptima de ccfDNA requerida para generar un perfil genético que cubre al menos 20 STR autosómicos utilizando el kit de plano de Forenseq Verogen. Esto implicará cuantificar los extractos de ADNmt y correlacionar estos valores con el volumen de sangre materna necesaria para obtener suficiente ADNA para el análisis. En última instancia, este estudio tiene como objetivo avanzar en la comprensión científica del análisis de ADNc en las mujeres embarazadas que usan tecnología MPS y, lo más importante, proporcionar apoyo crítico a las mujeres que quedan embarazadas después de la agresión sexual al permitirles confirmar la paternidad de su feto con certeza, abordando un aspecto crucial de su recuperación psicológica de su psicológica