Prenatal analyse af cellefri cirkulerende føtal DNA (APAFLC)

Formålet med denne undersøgelse er at validere en ikke-invasiv protokol til ekstraktion og rensning af ccfDNA fra moderlige blodprøver og analyse af føtal-DNA ved hjælp af MPS-teknologi til at etablere faderskab. For at udvikle denne metode vil der blive udført en foreløbig undersøgelse ved hjælp af blodprøver fra gravide, hvis partners identiteter er kendt. LHML har samarbejdet med professor Sentilhes 'team ved Bordeaux University Hospital Center for at få disse prøver.

Venøse blodprøver (~ 10 ml) opsamles fra gravide kvinder mellem 6 og 22 uger med amenoré i Paxgene -blod ccfDNA -rør (Qiagen) for at forhindre DNA -nedbrydning. Prøverne vil blive centrifugeret til separate plasma, og ccfDNA vil blive isoleret ved hjælp af EZ2 Connect FX -instrumentet og EZ1 & 2 ccfDNA -kittet (Qiagen). Parallelt indsamles buccale vatpinde fra mødrene og deres partnere som referenceprøver, der behandles ved hjælp af LHMLs rutinemæssige DNA -ekstraktionsprotokoller. Derudover indsamles og behandles navlestrengsblod fra nyfødte med en intern protokol for at opnå oprensede DNA-ekstrakter.

Disse referenceprøver giver os mulighed for at bekræfte de profiler, der tidligere blev identificeret for de gravide kvinder og fostre, men også for at validere filieringsanalysen mellem fosteret og hans far. Alle DNA-prøver vil blive kvantificeret ved hjælp af efterforskeren Quantiplex Pro Kit (Qiagen) og Quantstudio 5 realtid PCR-system (Applied Biosystems).

CCFDNA fra moderblod vil blive analyseret ved hjælp af MISEQ FGX -sekventeringssystemet (Verogen), det første NGS -instrument, der er valideret til retsmedicinsk genomik. Verogen Forenseq Mainstay Kit, der forstærker og sekvenser 27 autosomale STR'er, 25 y-strs og amelogenin, vil blive brugt. Denne tilgang sikrer pålidelig profilering, selv fra lavkoncentrerede ccfDNA -prøver med kapacitet til op til 96 biblioteker pr. Kørsel.

Reference-DNA fra buccale vatpinde og navlestrengsblod gennemgår parlamentsmedlemmer ved hjælp af det samme Verogen Forenseq Mainstay Kit og krydsvalideres med kapillærelektroforese ved hjælp af efterforskeren 24Plex QS Kit (Qiagen). Dataanalyse udføres med Forenseq Universal Analysis Software og et internt parentageanalyseprogram udviklet af LHML. Familias -softwaren kan også bruges til at beregne sandsynlighedsforhold for faderskabsbestemmelse. Alle databehandlingssystemer er offline for at sikre fortrolighed.

Denne åbne prospektive undersøgelse kræver prøver fra 20 komplette triader (mor, far, nyfødt) og vil tackle to store kritiske punkter. Det første mål er at bestemme kvalitetstærsklen for de genetiske profiler opnået med Verogen Forenseq Mainstay Kit, der er nødvendig til pålidelig faderskabsanalyse. Dette vil blive vurderet ved at beregne procentdelen af ​​validerede STR loci blandt de 27 autosomale STR'er, der er analyseret. Det andet fokus er at etablere den optimale ccfDNA -mængde, der kræves for at generere en genetisk profil, der dækker mindst 20 autosomale STR'er ved hjælp af Verogen Forenseq Mainstay Kit. Dette vil involvere kvantificering af ccfDNA -ekstrakterne og korrelere disse værdier med det moderlige blodvolumen, der er nødvendigt for at opnå tilstrækkeligt ccfDNA til analyse. I sidste ende sigter denne undersøgelse at fremme videnskabelig forståelse af ccfDNA -analyse hos gravide kvinder ved hjælp af MPS -teknologi og vigtigst af alt at yde kritisk støtte til kvinder, der bliver gravide efter seksuelt overgreb ved at gøre det muligt for dem