Analiza prenatalna bezkomórkowego krążącego DNA płodu (APAFLC)

Celem tego badania jest potwierdzenie nieinwazyjnego protokołu do ekstrakcji i oczyszczania ccfDNA z próbek krwi matki i analizy DNA płodu za pomocą technologii MPS w celu ustalenia ojcostwa. Aby opracować tę metodologię, wstępne badanie zostanie przeprowadzone przy użyciu próbek krwi od kobiet w ciąży, których tożsamość partnerów jest znana. LHML nawiązał współpracę z zespołem profesora Sentilhesa w Bordeaux University Hospital Center w celu uzyskania tych próbek.

Próbki krwi żylnej (~ 10 ml) zostaną pobrane od kobiet w ciąży od 6 do 22 tygodni Amenorrhea w rurkach CCFDNA krwi Paxgene CcfDNA (Qiagen), aby zapobiec degradacji DNA. Próbki zostaną odwirowane w celu oddzielnego osocza, a ccfDNA zostanie wyizolowany przy użyciu instrumentu EZ2 Connect FX i zestawu CCFDNA EZ1 i 2 (Qiagen). Równolegle wymazy policzkowe zostaną zebrane od matek i ich partnerów jako próbki referencyjne, przetwarzane przy użyciu rutynowych protokołów ekstrakcji DNA LHML. Ponadto krew pępowiny od noworodków zostanie zebrana i przetworzona z wewnętrznym protokołem w celu uzyskania oczyszczonych ekstraktów DNA.

Te próbki odniesienia pozwolą nam potwierdzić profile wcześniej zidentyfikowane dla kobiet w ciąży i płodów, ale także w celu potwierdzenia analizy Filiation między płodem a jego ojcem. Wszystkie próbki DNA zostaną określone ilościowo przy użyciu zestawu Investigator Quantiplex Pro (Qiagen) i systemu PCR w czasie rzeczywistym QuantStudio 5 (Applied Biosystems).

CCFDNA z krwi matki zostanie przeanalizowana przy użyciu systemu sekwencjonowania Miseq FGX (Verogen), pierwszego instrumentu NGS zatwierdzonego dla genomiki kryminalistycznej. Zestaw podstawowy Verogen Forenseq, który wzmacnia i sekwencje 27 autosomalne STR, 25 Y-STR i amelogenina. Takie podejście zapewnia niezawodne profilowanie nawet z niskich próbek ccfDNA o niskiej skoncentrowanej, z pojemnością do 96 bibliotek na bieg.

Odniesienie DNA z wymazów policzkowych i krwi pępowinowej ulegnie MPS przy użyciu tego samego zestawu wypoczynkowego Verogen Forenseq i zostanie weryfikowane krzyżowo z elektroforezą kapilarną przy użyciu zestawu badacza 24Plex QS (Qiagen). Analiza danych zostanie przeprowadzona za pomocą oprogramowania do analizy Universal Foreenseq i wewnętrznym programem analizy pochodzenia pochodzenia opracowanego przez LHML. Oprogramowanie Familias może być również wykorzystane do obliczenia współczynników prawdopodobieństwa do ustalenia ojcostwa. Wszystkie systemy przetwarzania danych są offline, aby zapewnić poufność.

To otwarte prospektywne badanie będzie wymagało próbek z 20 kompletnych triad (matka, ojciec, noworodek) i rozwiązuje dwa główne punkty krytyczne. Pierwszym celem jest określenie progu jakości profili genetycznych uzyskanych za pomocą zestawu podstawowego Verogena Forenseq niezbędnego do wiarygodnej analizy ojcowskiej. Zostanie to ocenione przez obliczenie procentu zatwierdzonych loci STR wśród 27 analizowanych autosomalnych STR. Drugim celem jest ustalenie optymalnej ilości ccfDNA wymaganej do wygenerowania profilu genetycznego obejmującego co najmniej 20 autosomalnych STR przy użyciu zestawu głównego Verogen Forenseq. Będzie to obejmować kwantyfikację ekstraktów ccfDNA i skorelowanie tych wartości z objętością krwi matki potrzebnej do uzyskania wystarczającej ilości ccfDNA do analizy. Ostatecznie badanie to ma na celu rozwinięcie naukowego zrozumienia analizy CCFDNA u kobiet w ciąży za pomocą technologii MPS i, co najważniejsze, zapewnienie krytycznego wsparcia kobietom, które zaszły w ciążę po napaści seksualnej poprzez umożliwienie im potwierdzenia ojcostwa ich płodu z pewnością, odnosząc się do kluczowego aspektu ich odzyskiwania psychologicznego