Análise pré-natal do DNA fetal circulante sem células (APAFLC)

O objetivo deste estudo é validar um protocolo não invasivo para extrair e purificar o ccfDNA de amostras de sangue materno e analisar o DNA fetal usando a tecnologia MPS para estabelecer paternidade. Para desenvolver essa metodologia, um estudo preliminar será realizado usando amostras de sangue de mulheres grávidas cujas identidades de parceiros são conhecidas. A LHML fez uma parceria com a equipe do Professor Sentilhes no Bordeaux University Hospital Center para obter essas amostras.

As amostras de sangue venoso (~ 10 mL) serão coletadas de mulheres grávidas entre 6 e 22 semanas de amenorréia nos tubos de ccfdna de sangue paxgene (Qiagen) para prevenir a degradação do DNA. As amostras serão centrifugadas para separar o plasma, e o ccfDNA será isolado usando o instrumento EZ2 Connect FX e o kit EZ1 e 2 ccfDNA (Qiagen). Paralelamente, os swabs bucais serão coletados das mães e de seus parceiros como amostras de referência, processadas usando os protocolos de extração de DNA de rotina do LHML. Além disso, o sangue do cordão umbilical dos recém-nascidos será coletado e processado com um protocolo interno para obter extratos de DNA purificados.

Essas amostras de referência nos permitirão confirmar os perfis anteriormente identificados para as mulheres grávidas e os fetos, mas também validam a análise de filiação entre o feto e seu pai. Todas as amostras de DNA serão quantificadas usando o Kit do Investigator Quantiplex Pro (Qiagen) e o sistema de PCR QuantStudio 5 em tempo real (Applied Biosystems).

O ccfDNA do sangue materno será analisado usando o sistema de seqüenciamento MISEQ FGX (verrogen), o primeiro instrumento NGS validado para a genômica forense. O kit dos pilares do VEROGEN FORENSEQ, que amplifica e seqüências 27 STRs autossômicos, 25 y-strs e amelogenina, serão usados. Essa abordagem garante perfil confiável, mesmo de amostras de ccfDNA com baixo teor concentrado, com capacidade para até 96 bibliotecas por execução.

O DNA de referência de swabs bucal e sangue umbilical passará por MPs usando o mesmo kit de bidente de verogen forenseq e será validado cruzado com eletroforese capilar usando o kit de qs do Investigador 24plex (Qiagen). A análise de dados será realizada com o software de análise universal do FORENSAL e um programa de análise de paternidade interno desenvolvido pelo LHML. O software Familias também pode ser usado para calcular taxas de verossimilhança para determinação da paternidade. Todos os sistemas de processamento de dados estão offline para garantir a confidencialidade.

Este estudo prospectivo aberto exigirá amostras de 20 tríades completas (mãe, pai, recém -nascido) e abordará dois grandes pontos críticos. O primeiro objetivo é determinar o limiar de qualidade dos perfis genéticos obtidos com o kit dos pilares do VEROGEN FORENSEQ necessário para uma análise de paternidade confiável. Isso será avaliado calculando a porcentagem de locos de STR validados entre os 27 STRs autossômicos analisados. O segundo foco é estabelecer a quantidade ideal de ccfDNA necessária para gerar um perfil genético que abrange pelo menos 20 STRsomais usando o kit dos pilares do VEROGEN FORENSEQ. Isso envolverá quantificar os extratos de ccfDNA e correlacionar esses valores com o volume sanguíneo materno necessário para obter ccfDNA suficiente para análise. Por fim, este estudo tem como objetivo promover a compreensão científica da análise de ccfDNA em mulheres grávidas usando a tecnologia deputados e, o mais importante, para fornecer apoio crítico às mulheres que engravidam após agressão sexual, permitindo que elas confirmem a paternidade de seu feto com certeza, abordando um aspecto crucial de sua recuperação psicológica