Analisi prenatale del DNA fetale circolante senza cellule (APAFLC)

L'obiettivo di questo studio è di convalidare un protocollo non invasivo per l'estrazione e la purificazione del CCFDNA dai campioni di sangue materno e l'analisi del DNA fetale usando la tecnologia MPS per stabilire la paternità. Per sviluppare questa metodologia, verrà condotto uno studio preliminare utilizzando campioni di sangue di donne in gravidanza le cui identità dei partner sono note. LHML ha collaborato con il team del Professor Sentilhes presso il Bordeaux University Hospital Center per ottenere questi campioni.

I campioni di sangue venoso (~ 10 mL) saranno raccolti da donne in gravidanza tra le 6 e le 22 settimane di amenorrea nei tubi di ccfDNA del sangue paxgene (Qiagen) per prevenire la degradazione del DNA. I campioni saranno centrifugati in plasma separato e il ccfDNA verrà isolato utilizzando lo strumento EZ2 Connect FX e il kit EZ1 e 2 CCFDNA (Qiagen). Parallelamente, i tamponi buccali saranno raccolti dalle madri e dai loro partner come campioni di riferimento, elaborati usando i protocolli di estrazione del DNA di routine di LHML. Inoltre, il sangue del cordone ombelicale dei neonati verrà raccolto ed elaborato con un protocollo interno per ottenere estratti di DNA purificati.

Questi campioni di riferimento ci consentiranno di confermare i profili precedentemente identificati per le donne in gravidanza e i feti, ma anche di convalidare l'analisi della filiazione tra il feto e suo padre. Tutti i campioni di DNA saranno quantificati utilizzando il kit quantiplex professionista (QIAGEN) e il sistema PCR QuantStudio 5 in tempo reale (Applied Biosystems).

Il CCFDNA dal sangue materno verrà analizzato utilizzando il sistema di sequenziamento MISEQ FGX (Verogen), il primo strumento NGS validato per la genomica forense. Verrà il kit Verogen forenseq mainstay, che amplifica e sequestra 27 STR autosomici, 25 Y-STR e amelogenina, verrà utilizzato. Questo approccio garantisce una profilazione affidabile anche da campioni di ccfDNA a basso concentrato, con una capacità di un massimo di 96 librerie per corsa.

Il DNA di riferimento da tamponi b L'analisi dei dati verrà eseguita con il software di analisi universale foranseq e un programma di analisi della genitorialità interna sviluppato da LHML. Il software Familias può anche essere utilizzato per calcolare i rapporti di probabilità per la determinazione della paternità. Tutti i sistemi di elaborazione dei dati sono offline per garantire la riservatezza.

Questo studio prospettico aperto richiederà campioni di 20 triadi completi (madre, padre, neonato) e affronterà due punti critici principali. Il primo obiettivo è determinare la soglia di qualità dei profili genetici ottenuti con il kit Verogen Forenseq MainStay necessario per l'analisi affidabile della paternità. Questo sarà valutato calcolando la percentuale di loci STR validati tra i 27 STR autosomici analizzati. Il secondo obiettivo è stabilire la quantità ottimale di ccfDNA richiesta per generare un profilo genetico che copre almeno 20 STR autosomiche utilizzando il kit di pilastro forenseq verogeno. Ciò comporterà la quantificazione degli estratti di ccfDNA e la correlazione di questi valori con il volume del sangue materno necessario per ottenere CCFDNA sufficiente per l'analisi. In definitiva, questo studio mira a far progredire la comprensione scientifica dell'analisi CCFDNA nelle donne in gravidanza che utilizzano la tecnologia MPS e, soprattutto, a fornire supporto critico alle donne che rimangono incinte a seguito di aggressioni sessuali consentendo loro di confermare la paternità del loro feto, affrontando un aspetto cruciale del loro aspetto cruciale di recupero psicologico