Pränatale Analyse der zellfreien zirkulierenden fetalen DNA (APAFLC)

Ziel dieser Studie ist es, ein nicht-invasives Protokoll zum Extrahieren und Reinigen von CCFDNA aus mütterlichen Blutproben zu validieren und die fetale DNA mithilfe der MPS-Technologie zur Herstellung der Vaterschaft zu analysieren. Um diese Methodik zu entwickeln, wird eine vorläufige Studie unter Verwendung von Blutproben von schwangeren Frauen durchgeführt, deren Partner die Identität bekannt sind. LHML hat sich mit dem Team von Professor Sentilhes am Bordeaux University Hospital Center zusammengetan, um diese Proben zu erhalten.

Venöse Blutproben (~ 10 ml) werden von schwangeren Frauen zwischen 6 und 22 Wochen Amenorrhoe in Paxgen -Blut -CCFDNA -Röhrchen (Qiagen) entnommen, um den DNA -Abbau zu verhindern. Die Proben werden zentrifugiert, um das Plasma zu trennen, und CCFDNA wird unter Verwendung des EZ2 Connect FX -Instruments und des EZ1- und 2 CCFDNA -Kits (QIAGEN) isoliert. Parallel dazu werden bukkale Tupfer von den Müttern und ihren Partnern als Referenzproben gesammelt, die unter Verwendung der Routine -DNA -Extraktionsprotokolle von LHML verarbeitet werden. Zusätzlich werden Nabelschnurblut von Neugeborenen mit einem internen Protokoll gesammelt und verarbeitet, um gereinigte DNA-Extrakte zu erhalten.

Diese Referenzproben ermöglichen es uns, die zuvor für die schwangeren Frauen und den Feten identifizierten Profile zu bestätigen, aber auch die Filiationsanalyse zwischen dem Fötus und seinem Vater zu validieren. Alle DNA-Proben werden mit dem Investigator Quantiplex Pro Kit (QIAGEN) und dem Echtzeit-PCR-System von Quantstudio 5 (angewandte Biosysteme) quantifiziert.

CCFDNA aus maternalem Blut wird unter Verwendung des MiSeq FGX -Sequenzierungssystems (Verogen) analysiert, dem ersten für die forensischen Genomik validierten NGS -Instrument. Das Verogen-Ferseq-Haupt-Stadion-Kit, das 27 autosomale STRs, 25 Jahre und Amelogenin verstärkt und Sequenzen, wird verwendet. Dieser Ansatz sorgt für eine zuverlässige Profilierung auch aus niedrig konzentrierten CCFDNA -Proben mit Kapazität von bis zu 96 Bibliotheken pro Lauf.

Referenz-DNA aus bukkalen Tupfer und Nabelblut wird mit dem gleichen Verogen-Ferseq-Hauptstein-Kit MPS unterzogen und mit der Kapillarelektrophorese unter Verwendung des Investigator 24plex QS-Kits (QIAGEN) gekreuzt. Die Datenanalyse wird mit der Forseq Universal Analysis-Software und einem von LHML entwickelten Inhouse Parentage-Analyseprogramm durchgeführt. Die Familias -Software kann auch verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeitsverhältnisse für die Bestimmung der Vaterschaft zu berechnen. Alle Datenverarbeitungssysteme sind offline, um die Vertraulichkeit zu gewährleisten.

Diese offene prospektive Studie erfordert Proben von 20 vollständigen Triaden (Mutter, Vater, Neugeborene) und wird zwei wichtige kritische Punkte angehen. Das erste Ziel ist es, die Qualitätsschwelle der mit dem Verogen Forseq Mainstay -Kit erhaltenen genetischen Profile zu bestimmen, die für eine zuverlässige Vaterschaftsanalyse erforderlich sind. Dies wird bewertet, indem der Prozentsatz der validierten STR -Loci unter den 27 analysierten autosomalen STRs berechnet wird. Der zweite Fokus liegt auf der Festlegung der optimalen CCFDNA -Menge, die erforderlich ist, um ein genetisches Profil zu erzeugen, das mindestens 20 autosomale STRs unter Verwendung des Verogen -Forseq -Mainstay -Kits abdeckt. Dies beinhaltet die Quantifizierung der CCFDNA -Extrakte und die Korrelation dieser Werte mit dem mütterlichen Blutvolumen, das erforderlich ist, um ausreichend ccfDNA für die Analyse zu erhalten. Letztendlich zielt diese Studie darauf ab, das wissenschaftliche Verständnis der CCFDNA -Analyse bei schwangeren Frauen mithilfe der MPS -Technologie voranzutreiben und vor allem Frauen, die nach sexuellen Übergriffen schwanger werden