Příprava IPSC pro editaci buněčných genů pro léčbu AATD

AAT se vyrábí hlavně v hepatocytech, proto korekce v hepatocytu je nejslibnějším přístupem. Buňky IHEP a také pluripotentní kmenové buňky nebo buňky odvozené z hepatocytů-podobných mezenchymálním kmenovým buňkám poskytují potenciální buněčné zdroje pro modelování onemocnění, transplantaci a tkáňové inženýrství nezávislé na dárcovských orgánech.

Všechny studie uvedené v literatuře, včetně velkého screeningu knihovny léčiva, jsou však založeny na jedné nebo několika variantě AAT nebo na většině málo buněčných linií HIPSC odvozených od pacientů s AATD. Kromě toho pouze podskupina 10% PI*ZZ vyvinula klinicky relevantní onemocnění jater a existuje silný podezřelý, že genetické a/nebo environmentální modifikátory určují, zda postižený homozygot je náchylný k onemocnění jater. Navíc neexistuje žádná studie o účinnosti potenciálního léčiva při snižování buněčné akumulace AAT pro jiné genotypy AAT spíše než na PI*Zz a pro jiné vzácné mutace spojené s inkluzemi jater a klinicky zjevné onemocnění jater. Toto omezení představuje silnou bariéru ve vývoji nových terapií. Z tohoto důvodu budou vyšetřovatelé vybírat kandidáty s různými profily nemocí. Vyšetřovatelé plánují najmout pacienty s různými genotypy, včetně nosičů vzácných patologických variant. IPSC bude generován z periferní krve a močových buněk, pak budou buňky charakterizovány a uloženy. PBMC bude zmrazen a bude přeprogramován na indukované pluripotentní kmenové buňky. Odvozený IPSC bude charakterizován standardními metodami imunofluroscence, qRTPCR, kombinované genomické hybridizace (CGH) a flowcytometrie a bude diferencován na tři zárodečné vrstvy.

Vyšetřovatelé dále rozlišují IPSC na hepatchocyty (IHEP). Pro mutace budou charakterizovány hepatocyty odvozené od IPSC od pacientů s nedostatkem AAT. Došlo k pokusům o vývoj cílení specifického pro hepatocyty, ale s omezeními proto v současném návrhu zaměřují se vyšetřovatelé zaměřit se na vývoj a testování dvou různých přístupů pro cílení specifické pro buňky: 1) podle liposomu/virosomu hepatocytů jako proteinové fragmenty nebo peptidy; 2) Potahování liposomu/virosomu nesoucího BES s hepatocytovou exovezickou povrchovou membránou a dodáváním BES v AATD IHEP, aby se otestovala proveditelnost této metody pro léčbu nedostatku AAT. Tyto hepatocyty budou ošetřeny BES a jeho účinek bude vyhodnocen hlubokým sekvenováním, imunohistochemií a sekrecí AAT bude potvrzena ELISA.

Základní úpravy je nově vznikající metoda přesné medicíny, kterou budou vyšetřovatelé používat jako léčba k léčbě AATD. Za účelem dosažení cíle zde vyšetřovatelé navrhují používat extracelulární vezikuly k dodávání základních editorů v játrech. Extracelulární vezikuly jsou vylučovány téměř všemi typy buněk a lze je použít jako nosiče potenciálních terapeutických proteinů. Ukázalo se, že úpravy bází je velmi slibnou technikou pro opravu genetické mutace. Několik výzev však zůstává nevyřešeno a v tomto grantu se vyšetřovatelé chtějí zabývat: specifičnost, stabilita, biologické distribuce a analýzu dlouhodobých účinků.