Analýza slinných proteinů u malých dětí jako zařízení pro zlepšení hodnocení rizika kazu (DecodECC)

Shrnutí projektu

Termín v raném dětském kazu (ECC) popisuje přítomnost jednoho nebo více rozpadu, chybějících (kvůli kazu) nebo naplněné primární zuby u dětí ve věku šesti let nebo mladší. Ukázalo se, že rizikové faktory pro ECC jsou častá konzumace cukru, nedostatečná ústní hygiena a kolonizace kariogenními bakteriemi, jako je skupina mutansových streptokoků, které jsou považovány za hlavní etiologické činidla zubního kazu u dětí. Jiné bakterie, jako je Prevotella spp. a Lactobacillus spp., stejně jako houba candida albicans, se ukázala jako vývoj a progresi ECC. Proteiny v lidských slinách mohou ovlivnit životaschopnost perorálních mikroorganismů různými vrozenými obrannými mechanismy, což ovlivňuje složení perorální mikroflóry. Současně bakterie produkují proteiny pro zvýšení různých procesů, např. Produkce polysacharidů. Zatímco slovo proteomika pokrývá zkoumání všech proteinů z jednoho druhu, metaproteomika se týká zkoumání proteinů z mikrobiálních komunit v interakci s hostitelem, např. Hostitel-Microbiota Crosstalk. Celkově by proteinové složení ve slinách malých dětí, ať už z mikrobiálního nebo lidského původu, mohlo pomoci při provádění biomarkerů pro včasnou diagnózu a také jako hodnocení rizika ECC.

Cílem této studie je prozkoumat celkové složení slinných proteinů v kohortách tříletých dětí ze švédských komunit s různým rizikem pro ECC pomocí vysoce výkonné proteomiky.

Stručně řečeno, 50 3letých dětí bude přijato ve dvou veřejných střediscích pro zdravotní péči o zubní zdravotní péči, Folktandvården Danderyd a Folktandvården Järva. Projekt je strukturován v klinické části (fáze 1) a ve analytické laboratorní části (fáze 2). 1. fáze bude zahrnovat náboj pacientů, sběr vzorků výtěru slin a klinické vyšetření, se zvláštním důrazem na přítomnost ECC. Fáze 2 zahrnuje molekulární analytickou část, během níž probíhá proteomická charakterizace slin. Tato molekulární analytická část bude provedena na Katedře zubního lékařství v Karolinska Institutet s podporou příslušných základních zařízení (bezstarostná).

Vyšetřovatelé předpokládají, že u dětí postižených ECC postiženými ve srovnání s dětmi bez kazu, a že jsou spojeny s již identifikovanými riziky pro ECC představované mezi dvěma kohorty pro komunitu, které jsou spojeny s již identifikovanými riziky pro proteomické proteomické a metaproteomické sliny.

Účel a cíl

Cílem tohoto projektu je využít proteomické technologie pro analýzu složení slin u dvou tříletých dětských kohort z komunit s dokumentovanými různými riziky kazu, za účelem identifikace budoucích molekulárních diagnostických faktorů pro podporu rizika a zdraví pro ECC.

Primární výzkumné otázky

• Může hostitelský proteom a profil metaproteomu (exprese a hojnost proteinu) vykazovat korelaci s prevalencí kazu mezi jednotlivci v různých kohortách ve studii?

Sekundární výzkumné otázky

1. Jak se liší profil kazu mezi přijatými dětskými kohortami z různých socioekonomicky charakterizovaných komunit ve Stockholmu?
2. Jak se liší profil proteomu a metaproteomu hostitele mezi dětmi postiženými v kazu a kazu?

3. Jak koreluje profil hostitele a profil metaproteomu s:

   • A) Rizikové faktory řešené v dotaznících pohovoru?
   • b) Klinický stav a závažnost prevalence kazu?

Vyšetřovatelé předpokládají, že vyšší prevalence ECC bude zaregistrována ve Folktandvården Järva ve srovnání s Folktandvården Danderyd a že bude existovat proteom (hostitel a mikrobiální) variace ve slinných složení podle klinických a socioekonomických rizik.

Pozadí

Kaz na raném dětství (ECC) je definován jako kaz nalezený v primárním chrupu dětí předškolního věku, tj. Děti mladší 6 let. Přestože byl v preventivní stomatologii prokázán významný pokrok, ECC zůstává pro mnoho dětí po celém světě hlavním zdravotním problémem. Přes omezené reprezentativní údaje ukazují zprávy z různých zemí, že prevalence ECC u dětí ve věku 2-3 let se obecně pohybuje od 12% - 27%. Ukázalo se, že ECC bude pravděpodobně považováno za převládající u sociálně znevýhodněných menšinových skupin s nižším příjmem. Předchozí studie prováděné v oblastech s vysokým rizikem zubního kazu ve Stockholmu naznačují, že imigrantské pozadí, s ohledem na faktory, jako je kultura, etnicita, životní styl, dietní vzor a praktiky ústní hygieny, je silným prediktorem vývoje ECC. To vede k hypotéze, že rozdíly v kariologickém stavu lze nalézt v socioekonomicky odlišných komunitách kraje Stockholm, jako jsou komunity Danderyd a Järva.

Dále byly sliny diskutovány jako klíčový biologický modulátor, který se podílí na udržování zdraví ústní dutiny. Na základě jednoduchosti a neinvazivity sběru vzorků slin se nedávno zvyšoval zájem o použití této složité tělesné tekutiny jako diagnostického nástroje.

Několik studií zkoumalo potenciální využití slinných proteinů jako biomarkerů pro frekvenci kazu a navrhovalo korelace mezi celkovou koncentrací i povahou slinných proteinů a výskytem zubního kazu.

Kromě toho byla nalezena silná korelace mezi vyššími hladinami mikrobiálních látek, jako jsou mutans streptokoky, Prevotella spp. A C. albicans, a zvýšenou prevalencí kazu u předškolních dětí. Zatímco termín proteomika zahrnuje studium všech proteinů z jednoho druhu, metaproteomika založená na hmotnostní spektrometrii se zaměřuje na charakterizaci proteinů bakteriálních komunit v interakci s hostitelem. V literatuře se pouze omezený počet studií zabýval metaproteome zubního kazu v biofilmech.

Tato zjištění však byla obvykle pozorována u dospívajících nebo dospělých a chybí zkoumání interakcí mezi perorálním mikrobiomem a hostitelským imunitním systémem u malých dětí.

Cílem této studie je tedy rozšířit znalosti lidských a bakteriálních metaproteomických charakteristik k implementaci potenciálních biomarkerů pro ECC, což pomáhá v prevenci, hodnocení rizik a terapii pro ECC.

Popis projektu

Tento křížový disciplinární projekt bude dosažen spoluprací mezi Folktandvårdenem ve Stockholmu Läns Landstinget (SLL) (Dr. Maria Anderson) a Katedra dentálního lékařství (KI) (Dr. Franziska Hetrodt a Prof. Georgios Belibasakis). Analytická část projektu bude dále podporována zařízením Proteomics Biomedicum v Ki Campus Solny. Tento projekt bude proveden v klinické (fázi 1) a laboratorní části (fáze 2). Pracovní postup proteomiky bude proveden podle zavedených protokolů.

Fáze 1. Nábor, klinické vyšetření a sběr vzorků slin Analýza výkonu, založená na dvoustranném testu rozptylu pro srovnání dvou skupin (proteom 3leté děti zkoumané ve Folktandvården Danderyd vs. 3leté děti zkoumané v 50%, a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a aku 10% přebytek pro zohlednění potenciálních výpadků nebo neúplných údajů odhalilo, že v obou studijních skupinách je vyžadována minimální velikost vzorku 50 účastníků.

Děti s ECC nebo bez ECC budou přijaty z kliniky Folktandvården v Järvě a Danderyd. Ve Švédsku je péče o zubní zdraví zdarma pro děti a první zubní vyšetření zdravotního stavu ústní dutiny se běžně provádí ve věku tří let. Z tohoto důvodu si kliniky Folktandvården ve Stockholmu uspořádají události, které hodnotí zdravotní stav orálních tříletých kojenců. Jedná se o jedinečnou příležitost shromažďovat a prozkoumat při jedné příležitosti velké komunitní skupiny dětí se stejným věkem a také srovnatelné environmentální a sociálně-ekonomické faktory.

Vyšetřovatelé proto usilují o dvě studijní kohorty sestávající z sebe-definovaných populací s kalibrovaným datem a časem. Nábor dvou studijních kohort bude monitorovat Dr. Maria Anderson a Dr. Franziska Hetrodt. Písemný informovaný souhlas bude získán jako předpoklad pro účast na studii. Zdravotní anamnéza bude odebrána a děti s nemocemi zasaženými do kazu, např. Astma, bude registrována. Pro každého účastníka studie budou zaznamenány demografické informace, jako je sex. Informace o obecných nemocí, stravovacích a zubních kartáčováních a sociokulturních faktorech, jako je jazyk, etické pozadí, úroveň vzdělání rodičů atd., Budou zaznamenány pomocí dotazníku.

Všichni pacienti (n = 100) budou požádáni, aby se zdrželi stravování, pití a všech postupů ústní hygieny po dobu 2 hodin před odběrem vzorků. Pacienti budou požádáni, aby si opláchli ústa vodou z vodovodu a čekali 5 minut, aby se zabránilo ředění vzorku. Sběr slin bude provádět metodu sběru slin na bázi výplek [Salivabio Children's Swab (položka č. 5001.06)]. Za tímto účelem budou bavlněné swapy jemně přesunuty pod jazykem, poté umístěny do 15 ml sterilních vzorkovacích zkumavek a okamžitě se chlazí, dokud se přenese do mrazničky -80 ° C pro snapky. Čas mezi získáváním vzorku a zmrazením by neměl překročit 30 minut, aby se zabránilo poškození vzorku. Každému vzorku, který je spojen s záznamem pacientů, bude poskytnut jedinečný ID kód. Před analýzou byly vzorky slin rozmrazeny na ledě, odstředěny (4000 ot / min, 20 minut, 4 ° C), aby se získaly supernatanty slin, a znovu zamrzly při -80 ° C až do dalšího použití. Klinické standardní vyšetření každého jednotlivého dítěte bude provedeno po získání vzorků slin kalibrovanými zkoušejícími (zubaři nebo dentální ústní hygienici). Kalibrace bude provedena s klinickými videi a pokyny před náborem studovaného člena. Frekvence kazu bude zaregistrována indexem rozpadaných zmeškaných zubů (DMFT) a sloučeny ICDA. Zubní ošetření bude provedeno, jak je uvedeno. Sběr slin, jakož i hodnocení zubních dentálních a klasifikace rizik v časopise Patient Journal T4 (Carestream Dental) provádějí zaměstnanci Folktandvården ve Stockholmu.

Fáze 2. proteomové profilování shromážděných slin vzorků vysokopustné proteomické analýzy prováděné v tomto projektu zahrnují jak hostitelskou proteomiku (lidské proteiny), tak metaproteomiku (polymikrobiální komunitní proteiny). Tyto analýzy vyžadují kombinaci odborných znalostí a zařízení poskytovaných v Ana Futura Laboratories v kampusu Flemingsberg a v proteomickém zařízení Biomedicum v kampusu Solny. Vzorky slin budou předběžné a poté zpracovány prostřednictvím kvantitativní proteomické analýzy bez štítků. Koncentrace proteinu vzorků bude měřena a poté zředěna na stejné množství (obvykle 20 ug/reakce). Pro hmotnostní spektrometrickou proteomickou analýzu s jedním buňkami budou jednotlivé buňky na 96-jamkových destičkách odeslány do zařízení proteomiky biomedicum v kampusu Solny a analyzovány v režimu servisu podle zavedených rutin. Stručně řečeno, vzorky nejprve podstoupí extrakci proteinu a trypsin-digest. Poté budou vzorky peptidu označeny pomocí tandemových hmotnostních značek (TMT) činidel, sušena a poté podrobena analýze kapalinové chromatografie s analýzou tandemové hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS). Získaná proteomová data pak budou anotována proti známým proteinovým databázím a budou hodnoceny vzorce regulace proteinů a obohacení cesty mezi různými studijními skupinami.

Obecná časová osa

Toto je 3 rok-projekt podle následujících kroků. Etická aplikace byla schválena během podzimu 2024 a klinická část (fáze 1) zahrnující nábor účastníků a sběr vzorků je plánována na jaro 2025. Laboratorní část (fáze 2) včetně analýzy slin bude zahájena po dokončení fáze 1 (podzim 2025 - podzim 2026), aby se zajistilo stejné zpracování všech vzorků. Bude provedena analýza dat a zjištění budou zveřejněna na podzim 2027.

Význam

Kaz z raného dětství je hlavním problémem pro zdraví ústních ústních a po celém světě ovlivňující kojence a předškolní děti. Hlavní rizikové faktory při tvorbě ECC mohou být kategorizovány jako mikrobiologické, dietní a environmentální rizikové faktory, jak se dříve ukázalo, že ECC se vyskytuje hlavně v sociálně znevýhodněných populacích. Při diagnostice ECC budou děti pravděpodobně vykazovat pokročilejší klinický obraz onemocnění v budoucnosti. Role molekulárních mechanismů a hostitelským mikrobiota přeslechnutí u dětí-aktivních vs. bez kazu vs. bez kazu, vs. bez kazu, nejsou zcela pochopena. Zjištění tohoto projektu přispějí k lepšímu pochopení vzhledu molekulárních způsobů a nakonec pomůže identifikovat potenciální terapeutické cíle a biomarkery pro diagnostiku a prevenci před klinickým projevem onemocnění. Kromě toho by mohly být nalezeny potenciální salutogenní biomarkery u dětí vystavených zranitelnému prostředí, ale přežívající bez kazu.