Analisi delle proteine ​​salivari nei bambini piccoli come dispositivo per migliorare la valutazione del rischio di carie (DecodECC)

Riepilogo del progetto

Il termine carie della prima infanzia (ECC) descrive la presenza di uno o più decaduti, mancanti (a causa della carie) o denti primari riempiti nei bambini di età pari o inferiore a sei anni. È stato dimostrato che i fattori di rischio per l'ECC sono un consumo di zucchero frequente, igiene orale inadeguata e la colonizzazione con batteri cariogenici, come il gruppo di mutani streptococchi, che sono considerati i principali agenti eziologici del decadimento dei denti nei bambini. Altri batteri, come Prevotella spp. e Lactobacillus spp., Oltre al fungo candida albicans, hanno dimostrato di essere associati allo sviluppo e alla progressione dell'ECC. Le proteine ​​nella saliva umana possono influenzare la vitalità dei microrganismi orali da vari meccanismi di difesa innati, influenzano così la composizione della microflora orale. Contemporaneamente i batteri producono proteine ​​per migliorare vari processi, ad esempio la produzione di polisaccaridi. Mentre la parola proteomica copre l'esplorazione di tutte le proteine ​​di una specie, la metaproteomica si riferisce allo studio delle proteine ​​delle comunità microbiche nell'interazione con l'ospite, ad es. Il crosstalk dell'ospite-microbiota. Nel complesso, la composizione proteica nella saliva dei bambini piccoli, che si tratti di origine microbica o umana, potrebbe aiutare nell'attuazione dei biomarcatori per la diagnosi precoce e nella valutazione del rischio di ECC.

Questo studio mira a esplorare la composizione proteica salivare complessiva nelle coorti di bambini di 3 anni provenienti da comunità svedesi con variazione variabile per l'ECC, usando proteomica ad alto rendimento.

In breve, 50 bambini di 3 anni saranno reclutati in due centri sanitari dentali pubblici, Folktandvården Danderyd e Folktandvården Järva, rispettivamente. Il progetto è strutturato in una parte clinica (stadio 1) e una parte di laboratorio analitico (stadio 2). La fase 1 comporterà il reclutamento di pazienti, la raccolta di campioni di tampone della saliva e l'esame clinico, con particolare enfasi sulla presenza di ECC. Lo stadio 2 comprende la parte analitica molecolare durante la quale avrà luogo la caratterizzazione proteomica della saliva. Questa parte analitica molecolare verrà eseguita presso il Dipartimento di Medicina Dentale presso l'Institutet di Karolinska, con il supporto delle rispettive strutture principali (Scalatless).

Gli investigatori ipotizzano che esistono profili proteomici e metaproteomici dell'ospite differenziale nei bambini colpiti dall'ECC rispetto ai bambini privi di carie e che questi sono associati a rischi già identificati per l'ECC posta tra le due coorti distinte dalla comunità.

Scopo e obiettivo

Questo progetto mira a utilizzare le tecnologie proteomiche per l'analisi della composizione della saliva in due coorti di bambini di 3 anni da comunità con rischi di carie diversi documentati, allo scopo di identificare i futuri fattori diagnostici molecolari per il rischio e la salute per l'ECC.

Domande di ricerca primarie

• Il profilo del proteoma e del metaproteoma dell'ospite può mostrare una correlazione con la prevalenza della carie tra gli individui nelle diverse coorti nello studio?

Domande di ricerca secondaria

1. In che modo il profilo della carie differisce tra le coorti infantili reclutati da diverse comunità socioeconomiche di Stoccolma?
2. In che modo il profilo del proteoma e del metaproteoma dell'ospite differisce tra i bambini colpiti dalla carie e senza carie?

3. In che modo il profilo del proteoma e del metaproteoma dell'ospite è correlato a:

   • a) Fattori di rischio affrontati nei questionari dell'intervista?
   • b) Lo stato clinico e la gravità della prevalenza della carie?

Gli investigatori ipotizzano che una maggiore prevalenza di ECC sarà registrata presso il Folktandvården Järva, rispetto al denteryd folktandvården e che ci saranno variazioni di proteoma (ospite e microbico) nella composizione salivari in base allo stato di rischio clinico e socioeconomico.

Sfondo

La carie della prima infanzia (ECC) è definita come carie trovata nella dentatura primaria dei bambini in età prescolare, vale a dire i bambini di età inferiore ai 6 anni. Anche se sono stati mostrati progressi significativi nell'odontoiatria preventiva, l'ECC rimane un grosso problema di salute per molti bambini in tutto il mondo. Nonostante i dati rappresentativi limitati, i rapporti di vari paesi mostrano che la prevalenza di ECC nei bambini di età compresa tra 2-3 anni varia dal 12% al 27%. È stato dimostrato che l'ECC è probabile che si trovi più prevalente nei gruppi di minoranza socialmente svantaggiati con un reddito inferiore. Precedenti studi condotti in aree con alto rischio di carie dentali a Stoccolma indicano che un background immigrato, considerando fattori come cultura, etnia, stile di vita, modello dietetico e pratiche di igiene orale, è un forte predittore per lo sviluppo dell'ECC. Ciò porta all'ipotesi che le differenze nello stato cariologico possano essere trovate in comunità socioeconomicamente diverse della contea di Stoccolma, come le comunità di Danderyd e Järva.

Inoltre, la saliva è stata discussa come un modulatore biologico cruciale, coinvolto nel mantenimento della salute orale. Sulla base della semplicità e della non invasività della raccolta dei campioni di saliva, recentemente c'è stato un crescente interesse per l'uso di questo complesso fluido corporeo come strumento diagnostico.

Numerosi studi hanno esplorato il potenziale uso delle proteine ​​salivari come biomarcatori per la frequenza della carie e hanno suggerito correlazioni tra entrambe la concentrazione totale, nonché la natura delle proteine ​​salivari e il verificarsi di carie dentali.

Inoltre, è stata trovata una forte correlazione tra livelli più elevati di microbici, come Mutans streptococchi, Prevotella spp. E C. albicans e aumento della prevalenza della carie nei bambini in età prescolare. Mentre il termine proteomica comporta lo studio di tutte le proteine ​​di una singola specie, la metaproteomica basata sulla spettrometria di massa si concentra sulla caratterizzazione delle proteine ​​delle comunità batteriche nell'interazione con l'ospite. In letteratura, solo un numero limitato di studi ha affrontato il metaproteoma delle carie dentali nei biofilm.

Tuttavia, questi risultati sono stati in genere osservati negli adolescenti o negli adulti e mancano indagini sulle interazioni tra il microbioma orale e il sistema immunitario ospite nei bambini piccoli.

Pertanto, questo studio mira ad espandere la conoscenza delle caratteristiche metaproteomiche umane e batteriche per implementare potenziali biomarcatori per l'ECC, aiutando la prevenzione, la valutazione del rischio e la terapia per l'ECC.

Descrizione del progetto

Questo progetto interdisciplinare sarà realizzato attraverso la collaborazione tra Folktandvården al Läns Landstinget di Stoccolma (SLL) (Dr. Maria Anderson) e il Dipartimento di Medicina Dentaria (KI) (Dr. Franziska Hetrodt e Prof. Georgios Belibasakis). Inoltre, la parte analitica del progetto sarà supportata dalla struttura del biomedico Proteomics presso KI Campus Solna. Questo progetto sarà eseguito all'interno di una parte clinica (stadio 1) e di una parte di laboratorio (stadio 2). Il flusso di lavoro della proteomica verrà eseguito secondo i protocolli stabiliti.

Stage 1. Recruitment, clinical examination, and saliva sample collection A power analysis, based on a two-tailed F test of variance for two-group comparison (proteome 3-year-old children examined in Folktandvården Danderyd vs 3-year-old children examined in Folktandvården Järva), with a minimum effect size of 2 (log2-fold changes), a minimum power of 80%, a significance level of 5%, and a 10% Eccesso per tenere conto di potenziali abbandoni o dati incompleti, ha rivelato una dimensione minima del campione di 50 partecipanti richiesti in entrambi i gruppi di studio.

I bambini con o senza ECC saranno reclutati dalla Folktandvården Clinic di Järva e Danderyd. In Svezia Dental Healthcare è gratuita per i bambini e il primo esame dentale dello stato di salute orale viene regolarmente eseguito all'età di tre anni. Per questo motivo, le cliniche Folktandvården di Stoccolma organizzano eventi che valutano lo stato di salute orale dei bambini di 3 anni. Questa è un'opportunità unica per raccogliere ed esaminare in un'occasione grandi gruppi di comunità di bambini con la stessa età, nonché fattori ambientali e socioeconomici comparabili.

Gli investigatori puntano quindi a due coorti di studio costituite da popolazioni auto-definite con data e ora calibrate. Il reclutamento delle due coorti di studio sarà monitorata dalla dott.ssa Maria Anderson e dalla dott.ssa Franziska Hetrodt. Il consenso informato scritto sarà ottenuto come prerequisito per la partecipazione allo studio. Verrà presa la storia medica e i bambini con malattie colpite dalla carie, ad es. asma, sarà registrato. Le informazioni demografiche come il sesso saranno registrate per ogni partecipante allo studio. Le informazioni sulle malattie generali, le abitudini alimentari e sulla spazzatura dei denti e sui fattori socioculturali, come la lingua, il background etico, il livello di istruzione dei genitori ecc. Saranno registrati per mezzo di un questionario.

Tutti i pazienti (n = 100) saranno richiesti di astenersi dal mangiare, bere e tutte le procedure di igiene orale per 2 ore prima del campionamento. Ai pazienti verrà chiesto di sciacquare la bocca con acqua di rubinetto e attendere 5 minuti per evitare la diluizione del campione. La collezione Saliva sarà eseguita con il metodo della collezione Saliva basata su tampone [Salite per bambini di salivabio (articolo n. 5001.06)]. Per questo, gli swap di cotone verranno spostati delicatamente sotto la lingua, quindi collocati in tubi da campionamento sterili da 15 ml e immediatamente refrigerati fino a quando non vengono trasferiti nel congelatore di -80 ° C per il congelamento a scatto. Il tempo tra l'acquisizione del campione e il congelamento non deve superare i 30 minuti per evitare danni da campione. Verrà assegnato un codice ID univoco a ciascun campione collegato al record dei pazienti. Prima dell'analisi, i campioni di saliva sono stati scongelati su ghiaccio, centrifugati (4000 giri / min, 20 minuti, 4 ° C) per ottenere supernatanti di saliva e congelati a -80 ° C di nuovo fino a un ulteriore utilizzo. L'esame standard clinico di ogni singolo bambino sarà condotto dopo l'acquisizione di campioni di saliva mediante esaminatori calibrati (dentisti o igienisti orali dentali). La calibrazione verrà eseguita con video clinici e istruzioni prima del reclutamento dei membri dello studio. La frequenza della carie sarà registrata dall'indice DMFT (DECAYED MISS PELLET DEETH) e ICDAS. Il trattamento dentale verrà eseguito come indicato. La raccolta della saliva, nonché la valutazione dentale e la classificazione del rischio nel Patient Journal T4 (CareStream Dental) è eseguita dai dipendenti di Folktandvården a Stoccolma.

Stadio 2. La profilazione del proteoma della saliva raccolta campiona le analisi di proteomiche ad alto rendimento eseguite in questo progetto includono sia la proteomica ospite (proteine ​​umane) che la metaproteomica (proteine ​​della comunità polimicrobica). Queste analisi richiedono la combinazione delle competenze e delle strutture fornite ai laboratori Ana Futura presso il campus Flemingsberg e nella struttura del biomedico Proteomics presso il campus Solna. I campioni di saliva verranno pre-gestiti e quindi elaborati attraverso un'analisi proteomica quantitativa senza etichetta. La concentrazione proteica dei campioni verrà misurata e quindi diluita alla stessa quantità (in genere 20 µg/reazione). Per l'analisi della proteomica a cella singola spettrometrica di massa, singole cellule in piastre da 96 pozzetti verranno inviate alla struttura del biomedico proteomico presso il campus Solna e analizzate in modalità di servizio secondo le routine stabilite. In breve, i campioni subiranno prima l'estrazione di proteine ​​e la tripsina-digest. Successivamente, i campioni di peptidi verranno etichettati con reagenti tag di massa tandem (TMT), essiccati e quindi sottoposti a cromatografia liquida con analisi di spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). I dati del proteoma acquisiti saranno quindi annotati contro i database proteici noti e saranno valutati i modelli di regolazione delle proteine ​​e gli arricchimenti di percorso tra i diversi gruppi di studio.

Cronologia generale

Questo è un progetto di 3 anni secondo i seguenti passaggi. L'applicazione etica è stata approvata durante l'autunno 2024 e la parte clinica (stadio 1) che comporta il reclutamento dei partecipanti e la raccolta dei campioni è prevista per la primavera del 2025. La parte di laboratorio (stadio 2), compresa l'analisi salivare, sarà avviata dopo il completamento della fase 1 (autunno 2025 - autunno 2026) per garantire la parità di elaborazione di tutti i campioni. Verrà condotta l'analisi dei dati e i risultati saranno pubblicati nell'autunno 2027.

Significato

La carie della prima infanzia è un grave problema di salute orale, che colpisce neonati e bambini in età prescolare in tutto il mondo. I principali fattori di rischio nella formazione di ECC possono essere classificati come fattori di rischio microbiologici, dietetici e ambientali, poiché in precedenza era stato dimostrato che l'ECC si verifica principalmente nelle popolazioni socialmente svantaggiate. Quando diagnosticati con ECC, i bambini probabilmente mostreranno un quadro clinico più avanzato della malattia in futuro. Finora, il ruolo dei meccanismi molecolari e del crosstalk dell'ospite-microbiota nei bambini carie-attivi contro senza carie, non sono completamente compresi. I risultati di questo progetto contribuiranno a una migliore comprensione della comparsa di modi molecolari e aiuteranno alla fine a identificare potenziali bersagli e biomarcatori terapeutici per la diagnosi e la prevenzione prima che si verifichino la manifestazione clinica della malattia. Inoltre, si possono trovare potenziali biomarcatori salutogenici per i bambini esposti a un ambiente vulnerabile, ma sopravvissuti senza carie.