Analyse av spyttproteiner hos små barn som en enhet for å forbedre karies risikovurdering (DecodECC)

Prosjektoppsummering

Begrepet karies for tidlig barndom (ECC) beskriver tilstedeværelsen av en eller flere forfalt, manglende (på grunn av karies) eller fylte primære tenner hos barn i alderen seks år eller yngre. Det er vist at risikofaktorer for ECC er hyppig sukkerforbruk, utilstrekkelig munnhygiene så vel som koloniseringen med kariogene bakterier, for eksempel gruppen av mutans streptokokker, som anses å være de viktigste etiologiske midlene til tannråte hos barn. Andre bakterier, for eksempel Prevotella spp. og Lactobacillus spp., så vel som sopp Candida albicans, ble vist å være assosiert med utviklingen og progresjonen av ECC. Proteiner i humant spytt kan påvirke levedyktigheten til orale mikroorganismer ved forskjellige medfødte forsvarsmekanismer, og påvirker dermed sammensetningen av oral mikroflora. Samtidig produserer bakterier proteiner for å forbedre forskjellige prosesser, for eksempel produksjon av polysakkarider. Mens ordet proteomikk dekker utforskningen av alle proteiner fra en art, angår metaproteomikk til undersøkelse av proteiner fra mikrobielle samfunn i interaksjon med verten, f.eks. Verten-Microbiota Crosstalk. Totalt sett kan proteinsammensetningen i små barns spytt, det være seg av mikrobiell eller menneskelig opprinnelse, hjelpe til med implementering av biomarkør for tidlig diagnose samt risikovurdering av ECC.

Denne studien tar sikte på å utforske den generelle spyttproteinsammensetningen i årskull hos 3 år gamle barn fra svenske samfunn med varierende risiko for ECC, ved bruk av proteomikk med høy gjennomstrømning.

I korte trekk vil 50 3 år gamle barn bli rekruttert på to offentlige tannhelsetjenester, henholdsvis Folktandvården Danderyd og Folktandvården Järva. Prosjektet er strukturert i en klinisk del (trinn 1) og en analytisk laboratoriedel (trinn 2). Fase 1 vil innebære rekruttering av pasienter, innsamling av spyttpinneprøver samt den kliniske undersøkelsen, med særlig vekt på tilstedeværelsen av ECC. Fase 2 omfatter den molekylære analytiske delen der den proteomiske karakteriseringen av spytt vil finne sted. Denne molekylære analytiske delen vil bli utført ved Institutt for tannlegemedisin ved Karolinska Institutet, med støtte fra de respektive kjernefasilitetene (Scaleless).

Etterforskerne antar at det er differensielle vertsproteomiske og metaproteomiske spyttprofiler hos ECC-berørte barn sammenlignet med kariesfrie barn, og at disse er assosiert med allerede identifiserte risikoer for ECC som er posert mellom de to samfunnsdistinkt kohortene.

Formål og mål

Dette prosjektet har som mål å bruke proteomiske teknologier for å analysere sammensetningen av spytt hos to 3 år gamle barn årskull fra lokalsamfunn med dokumenterte varierende kariesrisikoer, med det formål å identifisere fremtidige molekylære diagnostiske risiko- og helsefremmende faktorer for ECC.

Primære forskningsspørsmål

• Kan vertens proteom- og metaproteomprofil (proteinuttrykk og overflod) vise en korrelasjon med kariesprevalens blant individer i de forskjellige årskullene i studien?

Sekundære forskningsspørsmål

1. Hvordan skiller Caries -profilen seg mellom de rekrutterte barnekohortene fra forskjellige sosioøkonomisk karakteriserte samfunn i Stockholm?
2. Hvordan skiller vertenes proteom- og metaproteomprofil mellom karies-berørte og kariesfrie barn?

3. Hvordan korrelerer vertenes proteom- og metaproteomprofil med:

   • a) Risikofaktorer adressert i spørreskjemaer for intervju?
   • b) Den kliniske statusen og alvorlighetsgraden av kariesprevalens?

Etterforskerne antar at en høyere forekomst av ECC vil bli registrert på folktandvården Järva, sammenlignet med folktandvården danderyd og at det vil være proteome (vert og mikrobielle) variasjoner i spyttsammensetningen i henhold til kliniske og sosioøkonomiske risikostatus.

Bakgrunn

Karies for tidlig barndom (ECC) er definert som karies som finnes i den primære tannbehandlingen av førskolealder, dvs. barn yngre enn 6 år. Selv om betydelige fremskritt ble vist i forebyggende tannbehandling, er ECC fortsatt et stort helseproblem for mange barn over hele verden. Til tross for begrensede representative data, viser rapporter fra forskjellige land at utbredelsen av ECC hos barn i alderen 2-3 år generelt varierer fra 12% - 27%. Det er vist at ECC sannsynligvis vil bli funnet mer utbredt i sosialt vanskeligstilte minoritetsgrupper med lavere inntekt. Tidligere studier utført i områder med høy risiko for tann karies i Stockholm indikerer at en innvandrerbakgrunn, med tanke på faktorer som kultur, etnisitet, livsstil, kostholdsmønster og munnhygiene -praksis, er en sterk prediktor for utviklingen av ECC. Dette fører til hypotesen om at forskjeller i den kariologiske statusen kan finnes i sosioøkonomisk forskjellige samfunn i fylket Stockholm, som Danderd og Järva -samfunnene.

Videre har spytt blitt diskutert som en avgjørende biologisk modulator, involvert i opprettholdelse av oral helse. Basert på enkelheten og ikke -invasiviteten til spyttprøveinnsamling, har det nylig vært en økende interesse for bruken av denne komplekse kroppsvæsken som et diagnostisk verktøy.

Flere studier har undersøkt potensiell bruk av spyttproteiner som biomarkører for kariesfrekvens og antydet korrelasjoner mellom både den totale konsentrasjonen så vel som arten av spyttproteiner og forekomsten av tann karies.

I tillegg er det funnet en sterk korrelasjon mellom høyere nivåer av mikrobielle stoffer, for eksempel Mutans Streptococci, Prevotella spp. Og C. albicans, og økt kariesprevalens hos førskolebarn. Mens begrepet proteomikk involverer studie av alle proteiner fra en enkelt art, fokuserer massespektrometri-basert metaproteomikk på å karakterisere proteiner fra bakteriesamfunn i interaksjon med verten. I litteraturen har bare et begrenset antall studier adressert metaproteomet av tann karies i biofilmer.

Imidlertid har disse funnene typisk blitt observert hos ungdom eller voksne, og undersøkelser av interaksjonen mellom det orale mikrobiomet og vertsimmunsystemet hos små barn mangler.

Dermed tar denne studien som mål å utvide kunnskapen om menneskelige og bakterielle metaproteomiske egenskaper for å implementere potensielle biomarkører for ECC, hjelpe til med forebygging, risikovurdering og terapi for ECC.

Prosjektbeskrivelse

Dette tverrfaglige prosjektet vil bli oppnådd gjennom samarbeidet mellom folktandvården på Stockholms Läns Landstinget (SLL) (Dr. Maria Anderson) og Department of Dental Medicine (KI) (Dr. Franziska Hetrodt og prof. Georgios Belibasakis). Videre vil den analytiske delen av prosjektet bli støttet av Proteomics Biomedicum -anlegget på Ki Campus Solna. Dette prosjektet vil bli utført i en klinisk (trinn 1) og en laboratoriedel (trinn 2). Proteomics -arbeidsflyten vil bli utført i henhold til etablerte protokoller.

Fase 1. Rekruttering, klinisk undersøkelse og spyttprøveinnsamling En kraftanalyse, basert på en to-tailed F-test av varians for sammenligning av to grupper (Proteome 3 år gamle barn undersøkt i folktandvården danderyd vs 3-år gamle barn som er undersøkt i folktandvården Järva), med en minimum effekt av 2 (logToDvoRden Järva), med en minimum effekt av 2 (logktandvåren Järva), med en minimums barn på 2 (logert og en minimums en minimum ( Et overskudd på 10% for å gjøre rede for potensielle frafall eller ufullstendige data, avslørte en minimum prøvestørrelse på 50 deltakere som ble påkrevd i begge studiegruppene.

Barn med eller uten ECC vil bli rekruttert fra Folktandvården -klinikken i Järva og Danderyd. I Sverige er Dental Healthcare gratis for barn, og den første tannundersøkelsen av oral helsetilstand utføres rutinemessig i en alder av tre år. Av denne grunn arrangerer folktandvården-klinikkene i Stockholm hendelser som evaluerer den orale helsetilstanden til 3 år gamle spedbarn. Dette er en unik mulighet til å samle og undersøke ved en anledning store samfunnsgrupper av barn med samme alder, så vel som sammenlignbare miljø- og sosioøkonomiske faktorer.

Etterforskerne sikter derfor til to studiekohorter bestående av selvdefinerte populasjoner med kalibrert dato og tid. Rekrutteringen av de to studiekohortene vil bli overvåket av Dr. Maria Anderson og Dr. Franziska Hetrodt. Skriftlig informert samtykke vil bli innhentet som forutsetning for deltakelse i studien. Medisinsk historie vil bli tatt og barn med karies-berørte sykdommer, f.eks. Astma, vil bli registrert. Demografisk informasjon som sex vil bli registrert for hver studiedeltaker. Informasjon om generelle sykdommer, spising og tannbørstevaner samt sosiokulturelle faktorer, for eksempel språk, etisk bakgrunn, utdanningsnivå på foreldre osv. Vil bli registrert ved hjelp av et spørreskjema.

Alle pasienter (n = 100) vil bli bedt om å avstå fra å spise, drikke og alle oral hygieneprosedyrer i 2 timer før prøvetaking. Pasienter vil bli bedt om å skylle munnen med vann fra springen og vente i 5 minutter for å unngå prøvefortynning. Spyttkolleksjon vil bli utført av den svattbaserte Saliva-samlingsmetoden [Salivabio Children's Swab (punkt nr. 5001.06)]. For dette vil bomullsswapper bli forsiktig flyttet under tungen, deretter plassert i 15 ml sterile prøvestør og umiddelbart kjølet inn til de ble overført til -80 ° C fryser for å fryse. Tiden mellom prøveinnsamling og frysing skal ikke overstige 30 minutter for å unngå prøveskader. En unik ID -kode vil bli gitt til hver prøve som er koblet til pasientenes post. Før analysen ble spyttprøver tint på is, sentrifugert (4000 o / min, 20 minutter, 4 ° C) for å oppnå spytt supernatanter og frosset ved -80 ° C igjen til videre bruk. Klinisk standardundersøkelse av hvert enkelt barn vil bli utført etter anskaffelse av spyttprøver av kalibrerte sensorer (tannleger eller tannhygienister). Kalibrering vil bli utført med kliniske videoer og instruksjoner før rekruttering av studiemedlemmer. Kariesfrekvens vil bli registrert av den forfalne tapte fylte tennene (DMFT) -indeksen og ICDA -er slått sammen. Tannbehandling vil bli utført som indikert. Spyttkolleksjonen så vel som tannvaluering og risikoklassifisering i Patient Journal T4 (Carestream Dental) utføres av ansatte i Folktandvården i Stockholm.

Fase 2. Proteomprofilering av de innsamlede spyttprøvene Høyt gjennomstrømningsproteomikkanalyser utført i dette prosjektet inkluderer både vertsproteomikk (humane proteiner) og metaproteomikk (polymikrobielle samfunnsproteiner). Disse analysene trenger kombinasjonen av ekspertisen og fasilitetene som tilbys på ANA Futura Laboratories på Campus Flemingsberg og Proteomics Biomedicum -anlegget på Campus Solna. Spyttprøver vil bli forhåndshåndtert og deretter behandlet gjennom en etikettfri kvantitativ proteomisk analyse. Proteinkonsentrasjonen av prøvene vil bli målt og deretter fortynnet til samme mengde (typisk 20 ug/reaksjon). For massespektrometrisk enkeltcelleproteomikkanalyse vil enkeltceller i 96-brønners plater bli sendt til Proteomics Biomedicum-anlegget på Campus Solna og analysert i servicemodus i henhold til etablerte rutiner. Kort sagt vil prøvene først gjennomgå proteinekstraksjon og trypsin-fordøyeste. Deretter vil peptidprøver bli merket ved bruk av tandemmassetag (TMT) reagenser, tørket og deretter utsatt for væskekromatografi med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) -analyse. De anskaffede proteomdataene vil deretter bli merket mot kjente proteindatabaser, og proteinreguleringsmønstrene og banen beriker mellom de forskjellige studiegruppene vil bli vurdert.

Generell tidslinje

Dette er et 3 års prosjekt i henhold til følgende trinn. Den etiske anvendelsen ble godkjent i løpet av høsten 2024 og den kliniske delen (trinn 1) som innebærer deltakerrekruttering og prøveinnsamling er planlagt våren 2025. Laboratoriedelen (trinn 2) inkludert spyttanalyse vil bli startet etter fullføringen av trinn 1 (høsten 2025 - høsten 2026) for å sikre lik prosessering av alle prøver. Dataanalyse vil bli utført, og funn vil bli publisert høsten 2027.

Betydning

Karies for tidlig barndom er et viktig muntlig helseproblem, som påvirker spedbarn og førskolebarn over hele verden. De viktigste risikofaktorene i dannelsen av ECC kan kategoriseres som mikrobiologiske, kostholds- og miljømessige risikofaktorer, ettersom det tidligere ble vist at ECC hovedsakelig forekommer i sosialt vanskeligstilte populasjoner. Når de blir diagnostisert med ECC, vil barn sannsynligvis utvise et mer avansert klinisk bilde av sykdommen i fremtiden. Så langt er ikke rollen til molekylære mekanismer og vertsmikrobiota-krysset i kariesaktive kontra kariesfrie barn, helt forstått. Funnene av dette prosjektet vil bidra til en bedre forståelse av utseendet til molekylære måter og til slutt hjelpe til å identifisere potensielle terapeutiske mål og biomarkører for diagnose og forebygging før den kliniske manifestasjonen av sykdommen oppstår. I tillegg kan potensielle salutogene biomarkører bli funnet for barn utsatt for et sårbart miljø, men overlevende kariesfrie.