Análisis de proteínas salivales en niños pequeños como dispositivo para mejorar la evaluación de riesgos de caries (DecodECC)

Resumen del proyecto

El término caries de la primera infancia (ECC) describe la presencia de uno o más descompuesto, desaparecido (debido a caries) o llenó los dientes primarios en niños de seis años o menos. Se ha demostrado que los factores de riesgo para ECC son el consumo frecuente de azúcar, la higiene oral inadecuada, así como la colonización con bacterias cariogénicas, como el grupo de estreptococos de mutanes, que se consideran los principales agentes etiológicos de la caries dental en los niños. Otras bacterias, como Prevotella spp. y Lactobacillus spp., así como el hongo candida albicans, se demostró que se asocian con el desarrollo y la progresión de ECC. Las proteínas en la saliva humana pueden influir en la viabilidad de los microorganismos orales por varios mecanismos de defensa innatos, por lo que afectan la composición de la microflora oral. Simultáneamente, las bacterias están produciendo proteínas para mejorar varios procesos, por ejemplo, la producción de polisacáridos. Mientras que la palabra proteómica cubre la exploración de todas las proteínas de una especie, la metaproteómica se relaciona con la investigación de proteínas de las comunidades microbianas en interacción con el huésped, p. El anfitrión-microbiota diafonea. En general, la composición de proteínas en la saliva de los niños pequeños, ya sea de origen microbiano o humano, podría ayudar en la implementación de biomarcadores para el diagnóstico temprano, así como la evaluación de riesgos de ECC.

Este estudio tiene como objetivo explorar la composición general de proteínas salivales en cohortes de niños de 3 años de comunidades suecas de riesgo variable para ECC, utilizando proteómica de alto rendimiento.

En resumen, 50 niños de 3 años serán reclutados en dos centros públicos de salud dental, Folktandvården Danderyd y Folktandvården Järva, respectivamente. El proyecto está estructurado en una parte clínica (estadio 1) y una parte de laboratorio analítico (etapa 2). La etapa 1 implicará el reclutamiento de pacientes, la recolección de muestras de hisopos de saliva, así como el examen clínico, con especial énfasis en la presencia de ECC. La etapa 2 comprende la parte analítica molecular durante la cual tendrá lugar la caracterización proteómica de la saliva. Esta parte analítica molecular se realizará en el Departamento de Medicina Dental del Instituto Karolinska, con el apoyo de las instalaciones centrales respectivas (sin escalas).

Los investigadores plantean la hipótesis de que existen perfiles salivales proteómicos y metaproteómicos del huésped diferencial en niños afectados por ECC en comparación con los niños libres de caries, y que estos están asociados con riesgos ya identificados para el ECC planteados entre las dos cohortes directas comunitarias.

Propósito y objetivo

Este proyecto tiene como objetivo utilizar tecnologías proteómicas para analizar la composición de la saliva en dos cohortes de niños de 3 años de comunidades con riesgos de caries variables documentados, con el propósito de identificar futuros factores de riesgo de diagnóstico molecular y que promuevan la salud para el ECC.

Preguntas de investigación principales

• ¿Puede el perfil de proteoma y metaproteoma del huésped (expresión de proteínas y abundancia) mostrar una correlación con la prevalencia de caries entre los individuos en las diferentes cohortes en el estudio?

Preguntas de investigación secundaria

1. ¿Cómo difiere el perfil de caries entre las cohortes de niños reclutados de diferentes comunidades caracterizadas socioeconómicamente en Estocolmo?
2. ¿Cómo difiere el perfil de proteoma y metaproteoma del huésped entre los niños afectados por caries y sin caries?

3. ¿Cómo se correlaciona el perfil de proteoma y metaproteoma del huésped con:

   • A) ¿Factores de riesgo abordados en los cuestionarios de entrevistas?
   • b) El estado clínico y la gravedad de la prevalencia de caries?

Los investigadores plantean la hipótesis de que se registrará una mayor prevalencia de ECC en el folktandvården järva, en comparación con la danderyd de folktandvården y que habrá variaciones de proteoma (huésped y microbiano) en la composición salival de acuerdo con los estados de riesgo clínico y socioeconómico.

Fondo

La caries de la primera infancia (ECC) se define como la caries que se encuentra en la dentición primaria de niños en edad preescolar, es decir, niños menores de 6 años. Aunque se mostraron avances significativos en la odontología preventiva, el ECC sigue siendo un problema de salud importante para muchos niños en todo el mundo. A pesar de los datos representativos limitados, los informes de varios países muestran que la prevalencia de ECC en niños de 2 a 3 años generalmente varía del 12% al 27%. Se ha demostrado que es probable que ECC se encuentre más frecuente en grupos minoritarios socialmente desfavorecidos con menores ingresos. Estudios previos realizados en áreas con alto riesgo de caries dental en Estocolmo indican que un fondo de inmigrantes, considerando factores como la cultura, la etnia, el estilo de vida, el patrón dietético y las prácticas de higiene oral, es un fuerte predictor para el desarrollo de ECC. Esto lleva a la hipótesis de que las diferencias en el estado cariológico se pueden encontrar en comunidades socioeconómicamente diferentes del condado de Estocolmo, como las comunidades Danderyd y Järva.

Además, la saliva ha sido discutida como un modulador biológico crucial, involucrado en el mantenimiento de la salud bucal. Basado en la simplicidad y la no invasividad de la recolección de muestras de saliva, recientemente ha habido un interés creciente en el uso de este complejo fluido corporal como herramienta de diagnóstico.

Varios estudios han explorado el uso potencial de proteínas salivales como biomarcadores para la frecuencia de caries y sugeridas correlaciones entre la concentración total y la naturaleza de las proteínas salivales y la aparición de caries dental.

Además, se ha encontrado una fuerte correlación entre los niveles más altos de microbianos, como los estreptococos de mutan, Prevotella spp. Y C. albicans, y una mayor prevalencia de caries en niños preescolares. Mientras que el término proteómica implica el estudio de todas las proteínas de una sola especie, la metaproteómica basada en la espectrometría de masas se centra en caracterizar las proteínas de las comunidades bacterianas en interacción con el huésped. En la literatura, solo un número limitado de estudios ha abordado el metaproteoma de la caries dental en las biopelículas.

Sin embargo, estos hallazgos se han observado típicamente en adolescentes o adultos, y faltan investigaciones de las interacciones entre el microbioma oral y el sistema inmune del huésped en niños pequeños.

Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo ampliar el conocimiento de las características metaproteómicas humanas y bacterianas para implementar biomarcadores potenciales para el ECC, ayudando en la prevención, la evaluación de riesgos y la terapia para el ECC.

Descripción del proyecto

Este proyecto interdisciplinario se logrará a través de la colaboración entre folktandvården en Läns Landstinget (SLL) de Estocolmo (Dr. Maria Anderson) y el Departamento de Medicina Dental (KI) (Dr. Franziska Hetrodt y el Prof. Georgios Belibasakis). Además, la parte analítica del proyecto será respaldada por la instalación de proteómica biomedicum en Ki Campus Solna. Este proyecto se realizará dentro de una parte clínica (estadio 1) y una parte de laboratorio (etapa 2). El flujo de trabajo de proteómica se realizará de acuerdo con los protocolos establecidos.

Stage 1. Recruitment, clinical examination, and saliva sample collection A power analysis, based on a two-tailed F test of variance for two-group comparison (proteome 3-year-old children examined in Folktandvården Danderyd vs 3-year-old children examined in Folktandvården Järva), with a minimum effect size of 2 (log2-fold changes), a minimum power of 80%, a significance level of 5%, and a El exceso del 10% para tener en cuenta potenciales abandonos o datos incompletos, reveló un tamaño de muestra mínimo de 50 participantes requeridos en ambos grupos de estudio.

Los niños con o sin ECC serán reclutados de la Clínica Folktandvården en Järva y Danderyd. En Suecia, la atención médica dental es gratuita para los niños, y el primer examen dental del estado de salud bucal se realiza rutinariamente a la edad de tres años. Por esta razón, las clínicas folktandvården en Estocolmo organizan eventos que evalúan el estado de salud oral de los bebés de 3 años. Esta es una oportunidad única para reunir y examinar en una ocasión grandes grupos comunitarios de niños con la misma edad, así como factores ambientales y socioeconómicos comparables.

Por lo tanto, los investigadores apuntan a dos cohortes de estudio que consisten en poblaciones autodefinidas con fecha y hora calibradas. El reclutamiento de las dos cohortes de estudio será monitoreado por la Dra. Maria Anderson y el Dr. Franziska Hetrodt. El consentimiento informado por escrito se obtendrá como requisito previo para la participación del estudio. Se tomará el historial médico y los niños con enfermedades afectadas por la caries, p. asma, se registrará. La información demográfica como el sexo se registrará para cada participante del estudio. La información sobre enfermedades generales, hábitos de alimentación y cepillado de dientes, así como factores socioculturales, como el lenguaje, los antecedentes éticos, el nivel educativo de los padres, etc. se registrarán mediante un cuestionario.

Se solicitará a todos los pacientes (n = 100) que se abstengan de comer, beber y todos los procedimientos de higiene oral durante 2 h antes del muestreo. Se les pedirá a los pacientes que enjuague la boca con agua del grifo y esperen 5 minutos para evitar la dilución de la muestra. La recolección de saliva será realizada por el método de recolección de saliva basado en hisopos [SwaB de Salivabio Children (Artículo No. 5001.06)]. Para esto, los swaps de algodón se moverán suavemente debajo de la lengua, luego se colocarán en tubos de muestra estériles de 15 ml y se refrigeren inmediatamente hasta que se transfieran al congelador de -80 ° C para la congelación a presión. El tiempo entre la adquisición de la muestra y la congelación no debe exceder los 30 minutos para evitar el daño de la muestra. Se administrará un código de identificación único a cada muestra que esté vinculada al registro de los pacientes. Antes del análisis, las muestras de saliva se descongelaron en hielo, se centrifugaron (4000 rpm, 20 min, 4 ° C) para obtener sobrenadantes de saliva y se congelaron a -80 ° C nuevamente hasta su uso posterior. El examen estándar clínico de cada niño individual se realizará después de la adquisición de muestras de saliva por examinadores calibrados (dentistas o higienistas orales dentales). La calibración se realizará con videos e instrucciones clínicas antes del reclutamiento de miembros del estudio. La frecuencia de caries estará registrada por el índice de dientes llenos perdidos (DMFT) en descomposición y las ICDA fusionadas. El tratamiento dental se realizará como se indica. La recolección de saliva, así como la evaluación dental y la clasificación de riesgos en el Paciente Journal T4 (Carestream Dental) es realizada por empleados de Folktandvården en Estocolmo.

Etapa 2. El perfil de proteoma de las muestras de saliva recolectada Los análisis de proteómica de alto rendimiento realizados en este proyecto incluyen tanto la proteómica del huésped (proteínas humanas) como la metaproteómica (proteínas de la comunidad polimicrobiana). Estos análisis necesitan la combinación de la experiencia y las instalaciones proporcionadas en los Laboratorios ANA Futura en Campus Flemingsberg y la Instalación Proteomics Biomedicum en Campus Solna. Las muestras de saliva serán precipitadas y luego procesadas a través de un análisis proteómico cuantitativo sin etiqueta. La concentración de proteína de las muestras se medirá y luego se diluirá a la misma cantidad (típicamente 20 µg/reacción). Para el análisis de proteómica de una sola célula espectrométrica, las células individuales en placas de 96 pocillos se enviarán a la instalación de proteómica Biomedicum en Campus Solna y se analizarán en modo de servicio de acuerdo con las rutinas establecidas. En resumen, las muestras se someterán primero a extracción de proteínas y a la diga de tripsina. Posteriormente, las muestras de péptidos se marcarán con reactivos de etiqueta de masa en tándem (TMT), se secan y luego sometidas a cromatografía líquida con análisis de espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Los datos de proteoma adquiridos se anotarán contra bases de datos de proteínas conocidas, y se evaluarán los patrones de regulación de proteínas y los enriquecimientos de la vía entre los diferentes grupos de estudio.

Línea de tiempo general

Este es un proyecto de 3 años según los siguientes pasos. La aplicación ética se aprobó durante el otoño de 2024 y la parte clínica (etapa 1) que implica el reclutamiento de participantes y la recolección de muestras se planifica para la primavera de 2025. La parte de laboratorio (etapa 2), incluido el análisis salival, se iniciará después de la finalización de la etapa 1 (otoño 2025 - otoño 2026) para garantizar el procesamiento igual de todas las muestras. El análisis de datos se realizará y los resultados se publicarán en el otoño de 2027.

Significado

La caries de la primera infancia es un gran problema de salud bucal, que afecta a los bebés y niños en edad preescolar en todo el mundo. Los principales factores de riesgo en la formación de ECC pueden clasificarse como factores de riesgo microbiológicos, dietéticos y ambientales, ya que se demostró anteriormente que el ECC ocurre principalmente en poblaciones socialmente desfavorecidas. Cuando se diagnostica con ECC, los niños probablemente exhibirán una imagen clínica más avanzada de la enfermedad en el futuro. Hasta ahora, el papel de los mecanismos moleculares y la diafonía del huésped-microbiota en niños caries-activos versus caries libres no se comprenden completamente. Los resultados de este proyecto contribuirán a una mejor comprensión de la aparición de formas moleculares y ayudarán eventualmente a identificar posibles objetivos terapéuticos y biomarcadores para el diagnóstico y prevención antes de que ocurra la manifestación clínica de la enfermedad. Además, se pueden encontrar posibles biomarcadores salutogénicos para los niños expuestos a un entorno vulnerable, pero sobreviven sin caries.