Analyse von Speichelproteinen bei kleinen Kindern als Gerät zur Verbesserung der Karies -Risikobewertung (DecodECC)

Projektzusammenfassung

Der Begriff frühkindlicher Karies (ECC) beschreibt das Vorhandensein eines oder mehrerer verfallener, fehlender (aufgrund von Karies) oder gefüllter Primärzähne bei Kindern im Alter von sechs Jahren oder jünger. Es wurde gezeigt, dass Risikofaktoren für ECC häufiger Zuckerkonsum, unzureichende Mundhygiene sowie die Besiedlung mit kariogenen Bakterien wie die Gruppe von Mutans Streptococci sind, die als die wichtigsten ätiologischen Wirkstoffe des Zahnabfalls bei Kindern gelten. Andere Bakterien wie Prevotella spp. und Lactobacillus spp. sowie Pilz Candida albicans waren mit der Entwicklung und dem Fortschreiten von ECC verbunden. Proteine ​​im menschlichen Speichel können die Lebensfähigkeit oraler Mikroorganismen durch verschiedene angeborene Abwehrmechanismen beeinflussen und somit die Zusammensetzung der oralen Mikroflora beeinflussen. Gleichzeitig produzieren Bakterien Proteine, um verschiedene Prozesse zu verbessern, z. B. die Produktion von Polysacchariden. Während das Wort Proteomics die Untersuchung aller Proteine ​​aus einer Spezies abdeckt, bezieht sich die Metaproteomik auf die Untersuchung von Proteinen aus mikrobiellen Gemeinschaften in der Wechselwirkung mit dem Wirt, z. Der Wirt-Microbiota-Übersprechen. Insgesamt könnte die Proteinzusammensetzung im Speichel von kleinen Kindern, sei es mikrobieller oder menschlicher Herkunft, bei der Implementierung der Biomarker für die frühzeitige Diagnose sowie zur Risikobewertung von ECC beitragen.

Diese Studie zielt darauf ab, die gesamte Speichelproteinzusammensetzung in Kohorten von 3-jährigen Kindern aus schwedischen Gemeinden mit unterschiedlichem ECC-Risiko unter Verwendung von Proteomik mit hohem Durchsatz zu untersuchen.

Kurz gesagt, 50 3-jährige Kinder werden in zwei öffentlichen zahnärztlichen Gesundheitszentren, Folktandvården Danderyd bzw. Folktandvården Järva, rekrutiert. Das Projekt ist in einem klinischen Teil (Stadium 1) und einem analytischen Laborteil (Stufe 2) strukturiert. Stufe 1 wird die Rekrutierung von Patienten, die Sammlung von Speichelabstrichproben sowie die klinische Untersuchung mit besonderem Schwerpunkt auf das Vorhandensein von ECC mit sich bringen. Stadium 2 umfasst den molekularen analytischen Teil, in dem die proteomische Charakterisierung des Speichels stattfinden wird. Dieser molekulare analytische Teil wird am Institut der Abteilung für Zahnmedizin im Karolinska -Institut mit Unterstützung der jeweiligen Kerneinrichtungen (skalelos) durchgeführt.

Die Ermittler nehmen an, dass es im Vergleich zu kariesfreien Kindern differentielle proteomische und metaproteomische Speichelprofile bei ECC-betroffenen Kindern gibt, und dass diese mit bereits identifizierten Risiken für ECC verbunden sind, die zwischen den beiden Gemeindedistinenten-Kohorten aufgestellt wurden.

Zweck und Ziel

Dieses Projekt zielt darauf ab, proteomische Technologien zur Analyse der Zusammensetzung des Speichels in zwei 3-jährigen Kinderkohorten aus Gemeinden mit dokumentierten unterschiedlichen Kariesrisiken zu verwenden, um zukünftige molekulare diagnostische Risiko- und Gesundheitsförderungsfaktoren für ECC zu identifizieren.

Primärforschungsfragen

• Kann das Proteom- und Metaproteom -Profil des Wirts (Proteinexpression und -häufigkeit) eine Korrelation mit der Kariesprävalenz bei Individuen in den verschiedenen Kohorten in der Studie zeigen?

Sekundäre Forschungsfragen

1. Wie unterscheidet sich das Kariesprofil zwischen den rekrutierten Kinderkohorten aus verschiedenen sozioökonomisch charakterisierten Gemeinden in Stockholm?
2. Wie unterscheidet sich das Proteom- und Metaproteome-Profil des Wirts zwischen kariesbezogenen und kariesfreien Kindern?

3. Wie korreliert das Proteom- und Metaproteom -Profil des Hosts mit:

   • a) In Interview -Fragebögen gefährdete Risikofaktoren?
   • b) Der klinische Status und die Schwere der Kariesprävalenz?

Die Ermittler nehmen an, dass eine höhere Prävalenz von ECC bei der Folktandvården Järva im Vergleich zu Folktandvården Danderyd registriert wird und dass es proteom (Wirt und mikrobielle) Unterschiede in der Speichelzusammensetzung gemäß den klinischen und sozioökonomischen Risikostatus geben wird.

Hintergrund

Die frühe Kindheitskaries (ECC) wird als Karies definiert, die im primären Gebäude von Kindern im Vorschulalter, d. H. Kinder, die unter 6 Jahren sind, zu finden sind. Obwohl in der vorbeugenden Zahnheilkunde signifikante Fortschritte gezeigt wurden, bleibt die ECC für viele Kinder weltweit ein großes Gesundheitsproblem. Trotz begrenzter repräsentativer Daten zeigen Berichte aus verschiedenen Ländern, dass die Prävalenz von ECC bei Kindern im Alter von 2 bis 3 Jahren im Allgemeinen zwischen 12% und 27% liegt. Es wurde gezeigt, dass ECC in sozial benachteiligten Minderheitengruppen mit niedrigerem Einkommen wahrscheinlich häufiger vorkommt. Frühere Studien, die in Gebieten mit hohem Risiko für Zahnkaries in Stockholm durchgeführt wurden, zeigen, dass ein Einwandererhintergrund unter Berücksichtigung von Faktoren wie Kultur, ethnischer Zugehörigkeit, Lebensstil, Ernährungsmuster und Mundhygienepraktiken ein starker Prädiktor für die Entwicklung von ECC ist. Dies führt zu der Hypothese, dass Unterschiede im kariologischen Status in sozioökonomisch unterschiedlichen Gemeinden der Grafschaft Stockholm wie der Danderyd- und Järva -Gemeinden festgestellt werden können.

Darüber hinaus wurde Speichel als entscheidender biologischer Modulator diskutiert, der an der Aufrechterhaltung der Mundgesundheit beteiligt ist. Basierend auf der Einfachheit und Nichtinvasivität der Speichelprobenerfassung gab es in letzter Zeit ein zunehmendes Interesse an der Verwendung dieser komplexen Körperflüssigkeit als diagnostisches Instrument.

In mehreren Studien wurden die potenziellen Verwendung von Speichelproteinen als Biomarker für die Kariesfrequenz untersucht und auf Korrelationen sowohl zwischen der Gesamtkonzentration als auch der Art von Speichelproteinen und dem Auftreten von Zahnkaries hingewiesen.

Darüber hinaus wurde eine starke Korrelation zwischen höheren mikrobiellen Spiegeln wie Mutans Streptococci, Prevotella spp. Und C. albicans und erhöhte Kariesprävalenz bei Kindern im Vorschulalter festgestellt. Während der Begriff Proteomik die Untersuchung aller Proteine ​​einer einzelnen Spezies beinhaltet, konzentriert sich die Metaproteomik auf Massenspektrometrie auf die Charakterisierung von Proteinen bakterieller Gemeinschaften in der Interaktion mit dem Wirt. In der Literatur haben nur eine begrenzte Anzahl von Studien das Metaproteom von Zahnkaries in Biofilmen angesprochen.

Diese Ergebnisse wurden jedoch typischerweise bei Jugendlichen oder Erwachsenen beobachtet, und die Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen dem oralen Mikrobiom und dem Wirt -Immunsystem bei kleinen Kindern fehlen.

Daher zielt diese Studie darauf ab, das Wissen über menschliche und bakterielle Metaproteommerkmale zu erweitern, um potenzielle Biomarker für ECC umzusetzen und bei Prävention, Risikobewertung und Therapie für ECC zu helfen.

Projektbeschreibung

Dieses interdisziplinäre Projekt wird durch die Zusammenarbeit zwischen Folktandvården in Stockholms Längern Landstinget (SLL) durchgeführt (Dr. Maria Anderson) und die Abteilung für Zahnmedizin (KI) (Dr. Franziska Hetrodt und Prof. Georgios Belibasakis). Darüber hinaus wird der analytische Teil des Projekts von der Proteomics Biomedicum -Einrichtung auf der KI -Campus -Solna unterstützt. Dieses Projekt wird in einem klinischen (Stadium 1) und einem Laborteil (Stadium 2) durchgeführt. Der Proteomics -Workflow wird nach etablierten Protokollen durchgeführt.

Stadium 1. Rekrutierung, klinische Untersuchung und Speichelprobenerfassung Eine Leistungsanalyse auf der Grundlage eines zweiseitigen F-Varianztests für den Zwei-Gruppen-Vergleich (Proteom 3-jährige Kinder, die bei Folktandvården Danderyd gegen 3-jährige Kinder untersucht wurden, untersucht in Folktandvården Järva). Ein Überschuss von 10% zur Berücksichtigung potenzieller Abbrecher oder unvollständiger Daten ergab, dass in beiden Studiengruppen eine minimale Stichprobengröße von 50 Teilnehmern erforderlich war.

Kinder mit oder ohne ECC werden aus der Folktandvården -Klinik in Järva und Danderyd rekrutiert. In Schweden ist die Zahnpflege für Kinder kostenlos für Kinder, und die erste Zahnarztuntersuchung des Mundgesundheitsstatus wird routinemäßig im Alter von drei Jahren durchgeführt. Aus diesem Grund ordnen die Folktandvården-Kliniken in Stockholm Ereignisse an, die den Mundgesundheitsstatus von 3-jährigen Säuglingen bewerten. Dies ist eine einzigartige Gelegenheit, um einmal große Gemeinschaftsgruppen von Kindern mit gleichem Alter sowie vergleichbare ökologische und sozioökonomische Faktoren zu sammeln und zu untersuchen.

Die Forscher streben daher zwei Studienkohorten an, die aus selbstdefinierten Populationen mit kalibriertem Datum und Uhrzeit bestehen. Die Rekrutierung der beiden Studienkohorten wird von Dr. Maria Anderson und Dr. Franziska Hetrodt überwacht. Die schriftliche Einverständniserklärung wird als Voraussetzung für die Teilnahme an Studien eingeholt. Die Anamnese wird aufgenommen und Kinder mit Karies-betroffenen Krankheiten, z. Asthma wird registriert. Demografische Informationen wie Sex werden für jeden Studienteilnehmer aufgezeichnet. Informationen über allgemeine Krankheiten, Essens- und Zahnbürstengewohnheiten sowie über soziokulturelle Faktoren wie Sprache, ethischer Hintergrund, Bildungsniveau der Eltern usw. werden anhand eines Fragebogens erfasst.

Alle Patienten (n = 100) werden aufgefordert, 2 Stunden vor der Probenahme auf das Essen, das Trinken und alle Mundhygieneverfahren zu verzichten. Die Patienten werden gebeten, ihren Mund mit Leitungswasser abzuspülen und 5 Minuten zu warten, um eine Verdünnung der Proben zu vermeiden. Die Saliva-Sammlung wird von der Swab-basierten Speichel-Sammelmethode [Speichelkinder-Tupfer (Artikel Nr. 5001.06)] durchgeführt. Zu diesem Zweck werden Baumwolltausch sanft unter die Zunge bewegt, dann in 15 ml sterile Probenröhrchen gelegt und sofort gekühlt, bis sie zum Gefrierpunkt von -80 ° C übertragen werden. Die Zeit zwischen Probenerwerb und Einfrieren sollte 30 Minuten nicht überschreiten, um Probenschäden zu vermeiden. Jeder Stichprobe, das mit dem Datensatz der Patienten verknüpft ist, wird ein eindeutiger ID -Code angegeben. Vor der Analyse wurden Speichelproben auf Eis aufgetaut, zentrifugiert (4000 U / min, 20 min, 4 ° C), um Speichelüberstände zu erhalten, und bis zur weiteren Verwendung bei -80 ° C erneut gefroren. Die klinische Standarduntersuchung jedes einzelnen Kindes wird nach dem Erwerb von Speichelproben durch kalibrierte Prüfer (Zahnärzte oder Zahnärzte Mundhygieniker) durchgeführt. Die Kalibrierung wird vor der Einstellung von Mitgliedern mit klinischen Videos und Anweisungen durchgeführt. Die Kariesfrequenz wird durch den DMFT -Index (Fehlgefüllte Zähne) registriert und ICDAs fusioniert. Die Zahnbehandlung wird wie angegeben durchgeführt. Die Speichelsammlung sowie die zahnärztliche Bewertung und Risikoklassifizierung im Patientenjournal T4 (Carestream Dental) wird von Mitarbeitern von Folktandvården in Stockholm durchgeführt.

Stadium 2. Proteomprofilierung der gesammelten Speichelproben Die in diesem Projekt durchgeführten hohen Durchsatz -Proteomikanalysen umfassen sowohl Wirts -Proteomik (humane Proteine) als auch Metaproteomik (polymikrobielle Gemeinschaftsproteine). Diese Analysen benötigen die Kombination aus Fachwissen und Einrichtungen, die in den Ana Futura Laboratories auf dem Campus Flemingsberg und der Proteomics Biomedicum -Einrichtung auf dem Campus Solna bereitgestellt werden. Speichelproben werden vor dem Handel vor dem Handel und dann durch eine markierungsfreie quantitative proteomische Analyse verarbeitet. Die Proteinkonzentration der Proben wird gemessen und dann auf die gleiche Menge verdünnt (typischerweise 20 µg/Reaktion). Für die massenspektrometrische Einzelzell-Proteomik-Analyse werden Einzelzellen in 96-Well-Platten an die Proteomics Biomedicum-Einrichtung auf dem Campus-Solna gesendet und gemäß festgelegten Routinen im Servicemodus analysiert. Kurz gesagt, die Proben werden zunächst eine Proteinextraktion und Trypsin-Digest unterziehen. Danach werden Peptidproben unter Verwendung von Tandem-Mass-Tag (TMT) -Reagenzien markiert, getrocknet und dann einer Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) unterzogen. Die erfassten Proteomdaten werden dann mit bekannten Proteindatenbanken kommentiert, und die Proteinregulationsmuster und -Pfadeanreicherungen zwischen den verschiedenen Studiengruppen werden bewertet.

Allgemeine Zeitleiste

Dies ist nach den folgenden Schritten ein 3-Jahres-Projekt. Der ethische Antrag wurde im Herbst 2024 zugelassen und das klinische Teil (Stufe 1) mit der Einstellung der Teilnehmer und der Probensammlung ist für das Frühjahr 2025 geplant. Der Laborteil (Stadium 2) einschließlich Speichelanalyse wird nach Abschluss von Stadium 1 (Herbst 2025 - Herbst 2026) eingeleitet, um die gleiche Verarbeitung aller Proben sicherzustellen. Die Datenanalyse werden durchgeführt und die Ergebnisse im Herbst 2027 veröffentlicht.

Bedeutung

Frühkindliche Karies ist ein großes Problem der Mundgesundheit, das weltweit Säuglinge und Kinder im Vorschulalter betrifft. Die Hauptrisikofaktoren bei der Bildung von ECC können als mikrobiologische, diätetische und Umweltrisikofaktoren eingestuft werden, da zuvor gezeigt wurde, dass ECC hauptsächlich in sozial benachteiligten Populationen auftritt. Bei der Diagnose von ECC werden Kinder in Zukunft wahrscheinlich ein fortgeschrittenes klinisches Bild der Krankheit aufweisen. Bisher sind die Rolle der molekularen Mechanismen und des Wirts-Microbiota-Übersprechens bei kariesaktiven und kariesfreien Kindern nicht vollständig verstanden. Die Ergebnisse dieses Projekts werden zu einem besseren Verständnis des Auftretens molekularer Wege beitragen und letztendlich dazu beitragen, potenzielle therapeutische Ziele und Biomarker für Diagnose und Prävention zu identifizieren, bevor die klinische Manifestation der Krankheit auftritt. Darüber hinaus konnten potenzielle salutogene Biomarker für Kinder gefunden werden, die einer gefährdeten Umgebung ausgesetzt sind, aber kariesfreien überlebenden.