Анализ белков слюны у маленьких детей в качестве устройства для улучшения оценки риска кариеса (DecodECC)

Резюме проекта

Термин «ранний детство» (ECC) описывает наличие одного или нескольких разряженных, отсутствующих (из -за кариеса) или заполненных первичных зубов у детей в возрасте шести лет или моложе. Было показано, что факторами риска для ECC являются частые потребления сахара, неадекватная гигиена полости рта, а также колонизация с кариогенными бактериями, такими как группа Streppococci Mutans, которые считаются основными этиологическими агентами распада зубов у детей. Другие бактерии, такие как Prevotella spp. и Lactobacillus spp., Так же, как было показано, что грибок Candida albicans связаны с развитием и прогрессированием ECC. Белки в слюне человека могут влиять на жизнеспособность пероральных микроорганизмов различными врожденными защитными механизмами, таким образом влияя на состав пероральной микрофлоры. Одновременно бактерии продуцируют белки для усиления различных процессов, например, производство полисахаридов. В то время как слово «протеомика» охватывает исследование всех белков из одного вида, метапротеомика связана с исследованием белков из микробных сообществ при взаимодействии с хозяином, например, хозяин-микробиота. В целом, состав белка в слюне маленьких детей, будь то микробное или человеческое происхождение, может помочь в реализации биомаркера для ранней диагностики, а также в оценке риска ECC.

Это исследование направлено на изучение общего состава белка слюнного белка в когортах 3-летних детей из шведских общин с различным риском для ECC с использованием высокопроизводительной протеомики.

Вкратце, 50 3-летних детей будут набраны в двух общественных центрах здравоохранения, Фольктандворден Дандерид и Фольктандворден Ярва соответственно. Проект структурирован в клинической части (стадия 1) и аналитической лабораторной части (стадия 2). Стадия 1 повлечет за собой набор пациентов, сбор образцов мазки слюны, а также клиническое обследование, с особым акцентом на наличие ECC. Стадия 2 включает в себя молекулярную аналитическую часть, в ходе которой протеомная характеристика слюны будет иметь место. Эта молекулярная аналитическая часть будет выполнена в Департаменте стоматологической медицины в Каролинском институте с поддержкой соответствующих основных объектов (Scalless).

Исследователи предполагают, что существуют дифференциальные протеомные и метапрероомные профили слюны у детей, пострадавших от ECC, по сравнению с детьми без кариеса, и что они связаны с уже идентифицированными рисками для ECC, представленных между двумя общественными когортами.

Цель и цель

Этот проект направлен на использование протеомных технологий для анализа состава слюны в двух 3-летних детских когортах из сообществ с документированными различными рисками кариеса с целью выявления будущих молекулярных диагностических факторов риска и здоровья для ECC.

Первичные вопросы исследования

• Может ли профиль протеома и метапротеома хозяина (экспрессия и численность белка) показать корреляцию с распространенностью кариеса среди людей в различных когортах в исследовании?

Вторичные исследования

1. Как профиль кариеса отличается между набранными детскими когортами из различных социально -экономически охарактеризованных сообществ в Стокгольме?
2. Как протеом и метапрероте-профиль хозяина отличается между детьми без кариеса и без кариеса?

3. Как коррелирует профиль протеома и метапротеома хозяина:

   • а) Факторы риска, рассматриваемые в вопросниках для интервью?
   • б) клинический статус и тяжесть распространенности кариеса?

Исследователи предполагают, что более высокая распространенность ECC будет зарегистрирована в Folktandvården Järva, по сравнению с Folktandvården Danderyd и что в составе слюн в соответствии с статусами протеома (хозяина и микробным).

Фон

Кариес раннего детства (ECC) определяется как кариес, обнаруженный в первичном зубном протезе детей дошкольного возраста, то есть детей младше 6 лет. Несмотря на то, что в профилактической стоматологии были показаны значительные достижения, ECC остается серьезной проблемой для здоровья для многих детей во всем мире. Несмотря на ограниченные репрезентативные данные, отчеты из разных стран показывают, что распространенность ECC у детей в возрасте 2-3 лет обычно варьируется от 12% до 27%. Было показано, что ECC, вероятно, будет найдена более распространенным в социально неблагоприятном положении меньшинств с более низким доходом. Предыдущие исследования, проведенные в областях с высоким риском кариеса в Стокгольме, показывают, что опыт иммигрантов, с учетом таких факторов, как культура, этническая принадлежность, образ жизни, диетическая схема и практика гигиены полости рта, является сильным предиктором развития ECC. Это приводит к гипотезе о том, что различия в кариологическом статусе могут быть обнаружены в социально -экономически различных общинах графства Стокгольм, таких как общины Дандида и Ярва.

Кроме того, слюна обсуждалась как важный биологический модулятор, участвующий в поддержании здоровья полости рта. Основываясь на простоте и неинвазивности сбора образцов слюны, недавно был растущий интерес к использованию этой сложной жидкости тела в качестве диагностического инструмента.

В нескольких исследованиях было изучено потенциальное использование слюнных белков в качестве биомаркеров для частоты кариеса и предполагалось корреляции как между общей концентрацией, так и между природой слюнных белков и возникновением стоматологического кариеса.

Кроме того, была обнаружена сильная корреляция между более высокими уровнями микробов, такими как Mutans Streptococci, Prevotella spp. И C. albicans, и увеличение распространенности кариеса у детей дошкольного возраста. В то время как термин протеомика включает в себя изучение всех белков из одного вида, метапротеома на основе масс-спектрометрии фокусируется на характеристике белков бактериальных сообществ при взаимодействии с хозяином. В литературе лишь ограниченное количество исследований посвящено метапреротеому стоматологического кариеса в биопленках.

Тем не менее, эти результаты обычно наблюдались у подростков или взрослых, а также не хватает исследований взаимодействия между пероральным микробиомом и иммунной системой хозяина у маленьких детей.

Таким образом, это исследование направлено на расширение знаний о человеческих и бактериальных метапрерологических характеристиках для реализации потенциальных биомаркеров для ECC, оказания помощи в профилактике, оценке риска и терапии для ECC.

Описание проекта

Этот междисциплинарный проект будет выполнен в результате сотрудничества между Фолктандворденом в Стокгольме Läns Landstinget (SLL) (доктор Мария Андерсон) и Департамент стоматологической медицины (KI) (доктор Франзиска Хетродт и профессор Джорджиос Белибасакис). Кроме того, аналитическая часть проекта будет подтверждена протеомическим объектом Biomedicum в Кампусе Сольны Кампуса. Этот проект будет выполнен в клинической (стадии 1) и лабораторной части (этап 2). Протеомический рабочий процесс будет выполняться в соответствии с установленными протоколами.

Stage 1. Recruitment, clinical examination, and saliva sample collection A power analysis, based on a two-tailed F test of variance for two-group comparison (proteome 3-year-old children examined in Folktandvården Danderyd vs 3-year-old children examined in Folktandvården Järva), with a minimum effect size of 2 (log2-fold changes), a minimum power of 80%, a significance level of 5%, and a 10% избыток для учета потенциальных отсева или неполных данных, выявили минимальный размер выборки из 50 участников, необходимых в обеих исследовательских группах.

Дети с ECC или без него будут набраны из клиники Folktandvården в Järva и Danderyd. В Швеции стоматологическое здравоохранение бесплатно для детей, а первое стоматологическое обследование состояния здоровья полости рта обычно выполняется в возрасте трех лет. По этой причине клиники Folktandvården в Стокгольме организуют события, оценивающие состояние здоровья полости рта у 3-летних детей. Это уникальная возможность собрать и изучить в одном случае крупные общественные группы детей с тем же возрастом, а также сопоставимые экологические и социально-экономические факторы.

Поэтому исследователи стремятся к двум группам исследования, состоящей из самоопределенных популяций с калиброванной датой и временем. Набор двух учебных когортов будет контролироваться доктором Марией Андерсон и доктором Франзикой Хетродтом. Письменное информированное согласие будет получено как обязательное условие для участия в исследовании. История болезни будет взята, а дети с заболеваниями, затронутыми кариесом, например, Астма, будет зарегистрирована. Демографическая информация, такая как секс, будет записана для каждого участника исследования. Информация об общих заболеваниях, привычках питания и чистки зубов, а также социокультурных факторах, таких как язык, этический фон, уровень образования родителей и т. Д., Будет зарегистрирована с помощью вопросника.

Все пациенты (n = 100) будут просить воздерживаться от еды, питья и всех процедур гигиены полости рта за 2 часа до отбора проб. Пациентам будет предложено промыть рот водопроводной водой и подождать 5 минут, чтобы избежать разбавления образца. Коллекция слюны будет выполнена методом сбора слюны на основе мазки [Salivabio Children's Swab (пункт № 5001.06)]. Для этого хлопковые замены будут аккуратно перемещены под язык, затем помещены в 15 -мл стерильные пробирки для образцов и немедленно охлаждаются до переноса морозильной камеры -80 ° C для замороженного замораживания. Время между приобретением выборки и замораживанием не должно превышать 30 минут, чтобы избежать повреждения выборки. Уникальный идентификационный код будет предоставлен каждой выборке, которая связана с записью пациентов. Перед анализом образцы слюны оттаивали на льду, центрифугировали (4000 об / мин, 20 мин, 4 ° C) для получения супернатантов слюны и снова заморожены при -80 ° C до дальнейшего использования. Клиническое стандартное обследование каждого отдельного ребенка будет проводиться после приобретения образцов слюны калиброванными экзаменаторами (стоматологи или гигиенисты зубных полости рта). Калибровка будет выполняться с клиническими видео и инструкциями до найма участников исследования. Частота кариеса будет зарегистрирована по декаменным пропущенным заполненным зубам (DMFT), а ICDAS объединяется. Стоматологическое лечение будет выполняться, как указано. Сбор слюны, а также оценка зубов и классификацию рисков в журнале пациентов T4 (Carestream Dental) выполняется сотрудниками Folktandvården в Стокгольме.

Стадия 2. Профилирование протеома собранных образцов слюны. Протеомический анализ высокой пропускной способности, выполненный в этом проекте, включает как протеомику -хозяина (белки человека), так и метапреротеомику (белки полимикробной сообщества). Эти анализы нуждаются в сочетании экспертизы и объектов, предоставленных в лабораториях ANA Futura в кампусе Флемнгсберг и протеомике Biomedicum в кампусе Сольны. Образцы слюны будут предварительно обработаны, а затем обрабатываются с помощью количественного протеомного анализа без метки. Концентрация белка в образцах будет измерена, а затем разбавлена ​​до того же количества (обычно 20 мкг/реакция). Для масс-спектрометрического анализа одноклеточного протеомического анализа отдельные клетки в 96-луночных планшетах будут отправлены на протеомику Biomedicum в кампусе сольны и анализируются в режиме обслуживания в соответствии с установленными процедурами. Короче говоря, образцы сначала будут подвергаться экстракции белка и дигижного трипсина. После этого образцы пептидов будут помечены с использованием реагентов Tandem Mass Tag (TMT), высушенные, а затем подвергать жидкому хроматографии с помощью анализа тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Полученные данные протеома будут затем аннотироваться против известных баз данных белков, а также будут оценены паттерны регуляции белка и обогащения пути между различными исследовательскими группами.

Общая временная шкала

Это 3-летний проект в соответствии со следующими шагами. Этическое применение было одобрено в течение осени 2024 года, и клиническая часть (этап 1) влечет за собой набор персонала, а набор участников запланирован на весну 2025 года. Лабораторная часть (стадия 2), включая анализ слюны, будет инициирована после завершения стадии 1 (осень 2025 г. - осень 2026 года), чтобы обеспечить равную обработку всех образцов. Анализ данных будет проведен, и результаты будут опубликованы осенью 2027 года.

Значение

Кариес раннего детства - серьезная проблема со здоровьем полости рта, затрагивающая младенцев и дошкольных детей во всем мире. Основные факторы риска в формировании ECC могут быть классифицированы как микробиологические, диетические и экологические факторы риска, так как ранее было показано, что ECC встречается в основном в социально неблагоприятной популяции. При диагнозе с ECC дети, вероятно, будут проявлять более продвинутую клиническую картину заболевания в будущем. До сих пор роль молекулярных механизмов и перекрестных помех хозяина-микробиоты у детей-кариес-активных против кариеса, не до конца понятны. Результаты этого проекта будут способствовать лучшему пониманию появления молекулярных способов и помогут в конечном итоге выявить потенциальные терапевтические мишени и биомаркеры для диагностики и профилактики до возникновения клинического проявления заболевания. Кроме того, потенциальные салютогенные биомаркеры могут быть обнаружены для детей, подвергшихся воздействию уязвимой среды, но выживая без кариеса.