Analyse af spytproteiner hos små børn som en enhed til forbedring af kariesrisikovurderingen (DecodECC)

Projektoversigt

Udtrykket Early Childhood Caries (ECC) beskriver tilstedeværelsen af ​​en eller flere forfaldne, manglende (på grund af karies) eller fyldte primære tænder hos børn i alderen seks år eller yngre. Det er vist, at risikofaktorer for ECC er hyppigt sukkerforbrug, utilstrækkelige orale hygiejne såvel som koloniseringen med cariogene bakterier, såsom gruppen af ​​mutaner streptokokker, der betragtes som de vigtigste etiologiske midler til tandfald hos børn. Andre bakterier, såsom Prevotella spp. og Lactobacillus spp., såvel som svampe candida albicans, viste sig at være forbundet med udviklingen og progressionen af ​​ECC. Proteiner i humant spyt kan påvirke levedygtigheden af ​​orale mikroorganismer ved forskellige medfødte forsvarsmekanismer, hvilket således påvirker sammensætningen af ​​den orale mikroflora. Samtidig producerer bakterier proteiner til forbedring af forskellige processer, fx produktionen af ​​polysaccharider. Mens ordet proteomik dækker udforskningen af ​​alle proteiner fra en art, vedrører metaproteomics undersøgelsen af ​​proteiner fra mikrobielle samfund i interaktion med værten, f.eks. Host-Microbiota Crosstalk. Generelt kunne proteinsammensætningen hos små børns spyt, det være sig af mikrobiel eller menneskelig oprindelse, hjælpe med biomarkørimplementering til tidlig diagnose såvel som risikovurdering af ECC.

Denne undersøgelse sigter mod at undersøge den samlede spytproteinsammensætning i kohorter af 3-årige børn fra svenske samfund med varierende risiko for ECC ved anvendelse af proteomik med høj gennemstrømning.

Kort fortalt rekrutteres 50 3-årige børn på to offentlige tandlægecentre, henholdsvis Folkktandvården Danderyd og Folktandvården Järva. Projektet er struktureret i en klinisk del (trin 1) og en analytisk laboratorie del (trin 2). Trin 1 vil medføre rekruttering af patienter, indsamling af spytpindprøver såvel som den kliniske undersøgelse med særlig vægt på tilstedeværelsen af ​​ECC. Trin 2 omfatter den molekylære analytiske del, hvor den proteomiske karakterisering af spyt finder sted. Denne molekylære analytiske del vil blive udført på Institut for Dental Medicine i Karolinska Institutet med støtte fra de respektive kernefaciliteter (skalaer).

Undersøgere antager, at der er differentielle værtsproteomiske og metaproteomiske spytprofiler hos ECC-ramte børn sammenlignet med kariesfrie børn, og at disse er forbundet med allerede identificerede risici for ECC, der er stillet mellem de to samfundsdistinkt kohorter.

Formål og mål

Dette projekt har til formål at anvende proteomiske teknologier til analyse af spytsammensætningen hos to 3-årige børns kohorter fra samfund med dokumenterede varierende kariesrisici med det formål at identificere fremtidige molekylære diagnostiske risiko- og sundhedsfremmende faktorer for ECC.

Primære forskningsspørgsmål

• Kan værtens proteom- og metaproteomprofil (proteinekspression og overflod) vise en sammenhæng med karies -udbredelse blandt individer i de forskellige kohorter i undersøgelsen?

Sekundære forskningsspørgsmål

1. Hvordan adskiller Caries -profilen sig mellem de rekrutterede børnesammenter fra forskellige socioøkonomisk karakteriserede samfund i Stockholm?
2. Hvordan adskiller værtens proteom- og metaproteom-profil mellem karies-ramte og kariesfrie børn?

3. Hvordan korrelerer værtens proteom og metaproteomprofil med:

   • A) Risikofaktorer adresseret i spørgeskemaer i interview?
   • b) Den kliniske status og sværhedsgraden af ​​karies -udbredelse?

Undersøgere antager, at en højere udbredelse af ECC vil blive registreret på folktandvården Järva, sammenlignet med folktandvården Danderyd, og at der vil være proteom (vært og mikrobielle) variationer i spytsammensætningen i henhold til kliniske og socioøkonomiske risikostatus.

Baggrund

Karies (ESCH) er defineret som karies, der findes i den primære tandpræstation af børn i førskolealderen, dvs. børn yngre end 6 år. Selvom der blev vist betydelige fremskridt i forebyggende tandlæge, er ECC stadig et stort sundhedsspørgsmål for mange børn over hele verden. På trods af begrænsede repræsentative data viser rapporter fra forskellige lande, at forekomsten af ​​ECC hos børn i alderen 2-3 år generelt varierer fra 12% - 27%. Det er vist, at ECC sandsynligvis vil blive fundet mere udbredt i socialt dårligt stillede minoritetsgrupper med lavere indkomst. Tidligere undersøgelser udført i områder med høj risiko for tandkaries i Stockholm indikerer, at en indvandrerbaggrund, der overvejer faktorer som kultur, etnicitet, livsstil, diætmønster og mundhygiejnepraksis, er en stærk forudsigelse for udviklingen af ​​ECC. Dette fører til hypotesen om, at forskelle i den cariologiske status kan findes i socioøkonomisk forskellige samfund i amtet Stockholm, såsom Danderyd og Järva samfund.

Endvidere er spyt blevet diskuteret som en afgørende biologisk modulator, der er involveret i opretholdelsen af ​​oral sundhed. Baseret på enkelhed og ikke -invasivitet i spytprøvesamlingen har der for nylig været en stigende interesse for brugen af ​​denne komplekse kropsvæske som et diagnostisk værktøj.

Flere undersøgelser har undersøgt den potentielle anvendelse af spytproteiner som biomarkører for kariesfrekvens og foreslåede sammenhænge mellem både den samlede koncentration såvel som arten af ​​spytproteiner og forekomsten af ​​tandkaries.

Derudover er der fundet en stærk korrelation mellem højere niveauer af mikrobielle stoffer, såsom mutans streptococci, Prevotella spp., Og C. albicans og øget kariesprævalens hos førskolebørn. Mens udtrykket proteomik involverer undersøgelse af alle proteiner fra en enkelt art, fokuserer massespektrometri-baseret metaproteomik på at karakterisere proteiner fra bakteriesamfund i interaktion med værten. I litteraturen har kun et begrænset antal undersøgelser behandlet metaproteomet af tandkaries i biofilmer.

Imidlertid er disse fund typisk blevet observeret hos unge eller voksne, og undersøgelser af interaktioner mellem det orale mikrobiom og værtsimmunsystemet hos små børn mangler.

Således sigter denne undersøgelse at udvide viden om menneskelige og bakterielle metaproteomiske egenskaber til at implementere potentielle biomarkører for ECC, hjælpe med forebyggelse, risikovurdering og terapi for ECC.

Projektbeskrivelse

Dette tværfaglige projekt vil blive gennemført gennem samarbejdet mellem Folktandvården på Stockholms Läns Landstinget (SLL) (Dr. Maria Anderson) og Department of Dental Medicine (KI) (Dr. Franziska Hetrodt og professor Georgios Belibasakis). Endvidere understøttes den analytiske del af projektet af Proteomics Biomedicum -anlægget på Ki Campus Solna. Dette projekt vil blive udført inden for en klinisk (fase 1) og en laboratoriedel (trin 2). Proteomics -arbejdsgangen udføres i henhold til etablerede protokoller.

Trin 1.. Rekruttering, klinisk undersøgelse og spytprøvekollektion En magtanalyse, baseret på en to-halet F-test af varians for to-gruppers sammenligning (proteom 3-årige børn undersøgt i folktandvården Danderyd vs 3-årige børn undersøgt i folktandvården Järva), med en mindste effektstørrelse af 2 (log2-fold ændringer), en minimum af 80%, en betydning, en betydning af niveauet af niveauet af niveauet af niveauet af niveauet af niveauet af niveauet af niveauet af 2 5%, og et overskud på 10% for at redegøre for potentielle frafald eller ufuldstændige data, afslørede en minimumsprøvestørrelse på 50 deltagere, der kræves i begge studiegrupper.

Børn med eller uden ECC rekrutteres fra Folktandvården -klinikken i Järva og Danderyd. I Sverige er Dental Healthcare gratis for børn, og den første tandundersøgelse af den orale sundhedsstatus udføres rutinemæssigt i en alder af tre år. Af denne grund arrangerer folktandvården-klinikkerne i Stockholm begivenheder, der vurderer den mundtlige sundhedsstatus for 3-årige spædbørn. Dette er en unik mulighed for at samle og undersøge ved en lejlighed store samfundsgrupper af børn med samme alder samt sammenlignelige miljø- og socioøkonomiske faktorer.

Undersøgere sigter derfor mod to undersøgelsesgrupper, der består af selvdefinerede populationer med kalibreret dato og tid. Rekrutteringen af ​​de to studiekohorter overvåges af Dr. Maria Anderson og Dr. Franziska Hetrodt. Skriftligt informeret samtykke opnås som en forudsætning for undersøgelsesdeltagelse. Medicinsk historie vil blive taget, og børn med karies-ramte sygdomme, f.eks. Astma, vil blive registreret. Demografiske oplysninger såsom sex registreres for hver undersøgelsesdeltager. Oplysninger om generelle sygdomme, spisning og tandbørstevaner samt sociokulturelle faktorer, såsom sprog, etisk baggrund, uddannelsesniveau for forældre osv. Vil blive registreret ved hjælp af et spørgeskema.

Alle patienter (n = 100) vil blive anmodet om at undlade at spise, drikke og alle orale hygiejneprocedurer i 2 timer før prøveudtagning. Patienter vil blive bedt om at skylle munden med ledningsvand og vente i 5 minutter for at undgå prøveudvidelse. Spytkollektion udføres af den pindebaserede spytopsamlingsmetode [Salivabio Children's Swab (vare nr. 5001.06)]. Til dette flyttes bomuldsswaps forsigtigt under tungen, derefter anbringes i 15 ml sterile prøvebør og køles straks, indtil den overføres til -80 ° C -fryseren til snapfrysning. Tiden mellem prøveoptagelse og frysning bør ikke overstige 30 minutter for at undgå prøveskader. Der gives en unik ID -kode til hver prøve, der er knyttet til patienternes post. Før analysen blev spytprøver optøet på is, centrifugeret (4000 o / min, 20 minutter, 4 ° C) for at opnå spyt -supernatanter og frosset ved -80 ° C igen indtil yderligere anvendelse. Klinisk standardundersøgelse af hvert enkelt barn vil blive gennemført efter erhvervelse af spytprøver af kalibrerede eksaminatorer (tandlæger eller tandlægehygienister). Kalibrering udføres med kliniske videoer og instruktioner inden rekruttering af studiemedlemmet. Caries -frekvens vil blive registreret af det forfaldne ubesvarede fyldte tænder (DMFT) -indeks og ICDA'er fusioneret. Tandbehandling udføres som angivet. Spytkollektionen såvel som tandlægevaluering og risikoklassificering i Patient Journal T4 (Carestream Dental) udføres af medarbejdere i Folkktandvården i Stockholm.

Trin 2. Proteomprofilering af de indsamlede spytprøver De høje kapacitetsproteomiske analyser udført i dette projekt inkluderer både værtsproteomik (humane proteiner) og metaproteomics (polymikrobielle samfundsproteiner). Disse analyser har brug for kombinationen af ​​ekspertise og faciliteter, der leveres på Ana Futura Laboratories på Campus Flemingsberg og Proteomics Biomedicum Facility på Campus Solna. Spytprøver vil blive forhåndshandret og behandles derefter gennem en etiketfri kvantitativ proteomisk analyse. Proteinkoncentrationen af ​​prøverne måles og fortyndes derefter til det samme beløb (typisk 20 ug/reaktion). Til massespektrometrisk enkeltcelleproteomisk analyse vil enkeltceller i 96-brøndsplader blive sendt til Proteomics Biomedicum-anlægget på campus Solna og analyseret i servicetilstand i henhold til etablerede rutiner. Kort fortalt vil prøverne først gennemgå proteinekstraktion og trypsin-fordøjelse. Derefter vil peptidprøver blive mærket ved anvendelse af tandem-masse-tag (TMT) reagenser, tørret og derefter udsat for væskekromatografi med tandem-massespektrometri (LC-MS/MS) -analyse. De erhvervede proteomdata vil derefter blive kommenteret mod kendte proteindatabaser, og proteinreguleringsmønstrene og -baneberigelser mellem de forskellige studiegrupper vil blive vurderet.

Generel tidslinje

Dette er et 3-årigt projekt i henhold til følgende trin. Den etiske anvendelse blev godkendt i efteråret 2024, og den kliniske del (trin 1), der indebærer deltagerens rekruttering og prøvekollektion, er planlagt til foråret 2025. Laboratoriedelen (trin 2) inklusive spytanalyse vil blive initieret efter afslutningen af ​​trin 1 (efterår 2025 - efterår 2026) for at sikre lige behandling af alle prøver. Dataanalyse vil blive gennemført, og resultaterne vil blive offentliggjort i efteråret 2027.

Betydning

Karies i den tidlige barndom er et stort mundtligt sundhedsproblem, der påvirker spædbørn og børnehavebørn over hele verden. De vigtigste risikofaktorer i dannelsen af ​​ECC kan kategoriseres som mikrobiologiske, kost- og miljømæssige risikofaktorer, da det tidligere blev vist, at ECC hovedsageligt forekommer i socialt dårligt stillede populationer. Når de diagnosticeres med ECC, vil børn sandsynligvis udvise et mere avanceret klinisk billede af sygdommen i fremtiden. Indtil videre er rollen af ​​molekylære mekanismer og værtsmikrobiota-krydstal i karies-aktive vs. kariesfrie børn ikke fuldt ud forstået. Resultaterne af dette projekt vil bidrage til en bedre forståelse af udseendet af molekylære måder og hjælpe til sidst med at identificere potentielle terapeutiske mål og biomarkører til diagnose og forebyggelse inden den kliniske manifestation af sygdommen forekommer. Derudover kunne der findes potentielle salutogene biomarkører for børn, der udsættes for et sårbart miljø, men overlevende kariesfri.