Analiza białek ślinowych u małych dzieci jako urządzenia do poprawy oceny ryzyka próchnicy (DecodECC)

Podsumowanie projektu

Termin wczesny dzieciństwo (ECC) opisuje obecność jednego lub więcej zepsutych, zaginionych (z powodu próchnicy) lub wypełnionych zębów pierwotnych u dzieci w wieku sześciu lat lub młodszych. Wykazano, że czynnikami ryzyka ECC są częste zużycie cukru, nieodpowiednią higienę jamy ustnej, a także kolonizacja bakteriami kariogennymi, takimi jak grupa mutanów streptococci, które są uważane za główne środki etiologiczne rozkładu zębów u dzieci. Inne bakterie, takie jak Prevotella spp. i wykazano, że Lactobacillus spp., a także grzybów candida albicans, są powiązane z rozwojem i postępem ECC. Białka w ludzkiej ślinie mogą wpływać na żywotność doustnych mikroorganizmów przez różne wrodzone mechanizmy obronne, a zatem wpływają na skład doustnej mikroflory. Jednocześnie bakterie wytwarzają białka w celu zwiększenia różnych procesów, np. Produkcji polisacharydów. Podczas gdy słowo proteomika obejmuje badanie wszystkich białek z jednego gatunku, metaproteomika odnosi się do badania białek ze społeczności drobnoustrojów w interakcji z gospodarzem, np. Przesłuch gospodarza-mikrobiota. Ogólnie rzecz biorąc, skład białka w ślinie małych dzieci, niezależnie od pochodzenia drobnoustrojowego, czy ludzkiego, może pomóc we wdrażaniu biomarkerów do wczesnej diagnozy, a także w ocenie ryzyka ECC.

Badanie to ma na celu zbadanie ogólnego składu białka w ślinie w kohortach 3-letnich dzieci ze szwedzkich społeczności o różnym ryzyku ECC, przy użyciu proteomiki o wysokiej przepustowości.

W skrócie, 50 3-letnich dzieci zostanie rekrutowanych odpowiednio w dwóch publicznych ośrodkach opieki zdrowotnej dentystycznej, odpowiednio Folktandvården Danderyd i Folktandvården Järva. Projekt jest ustrukturyzowany w części klinicznej (etap 1) i analitycznej części laboratoryjnej (etap 2). Etap 1 będzie pociągnął za sobą rekrutację pacjentów, pobór próbek wymazu śliny, a także badanie kliniczne, ze szczególnym naciskiem na obecność ECC. Etap 2 obejmuje molekularną część analityczną, podczas której nastąpi charakterystyka proteomiczna śliny. Ta część molekularna analityczna zostanie wykonana na Wydziale Medycyny dentystycznej w Karolinska Institutet, przy wsparciu odpowiednich obiektów podstawowych (skalless).

Badacze hipotezują, że istnieją zróżnicowane profile proteomiczne i metaprototeomiczne saliwskie u dzieci dotkniętych ECC w porównaniu z dziećmi wolnymi od próchnicy, i że są one związane z już zidentyfikowanym ryzykiem dla ECC stwarzanych między dwiema kohortami odwrotności społecznej.

Cel i cel

Projekt ten ma na celu wykorzystanie technologii proteomicznych do analizy składu śliny u dwojga kohortów 3-letnich dzieci ze społeczności z udokumentowanym różnym ryzykiem próchnicy, w celu identyfikacji przyszłych czynników ryzyka diagnostyki molekularnej i czynników promujących zdrowie dla ECC.

Podstawowe pytania badawcze

• Czy profil proteomu i metaproteomu gospodarza (ekspresja i obfitość białka) może wykazywać korelację z rozpowszechnieniem próchnicy wśród osób w różnych kohortach w badaniu?

Wtórne pytania badawcze

1. Czym różni się profil próchnicy między rekrutowanymi kohortami dziecięcymi od różnych społeczności scharakteryzowanych społeczno -ekonomicznie w Sztokholmie?
2. Czym różnią się profil proteomu i metaproteomu gospodarza między dziećmi dotkniętymi próchnicą a próchnicą?

3. Jak koreluje proteom proteomowy i metaproteomu gospodarza:

   • a) Czynniki ryzyka poruszone w kwestionariuszach wywiadu?
   • b) Status kliniczny i nasilenie rozpowszechnienia próchnicy?

Badacze hipotezują, że większa częstość występowania ECC zostanie zarejestrowana w folktandvården järva, w porównaniu z folktandvården danderyd i że będą proteom (żywiciela i mikrobiologiczna) w składzie śliniaka według stanu klinicznego i społeczno -ekonomicznego.

Tło

Wczesne próchnice (ECC) definiuje się jako próchnica znaleziona w pierwotnym uzębieniu dzieci w wieku przedszkolnym, tj. Dzieci w wieku poniżej 6 lat. Mimo że w stomatologii profilaktycznej wykazano znaczne postępy, ECC pozostaje poważnym problemem zdrowotnym dla wielu dzieci na całym świecie. Pomimo ograniczonych reprezentatywnych danych, raporty z różnych krajów pokazują, że rozpowszechnienie ECC u dzieci w wieku 2-3 lat zwykle wynosi od 12% - 27%. Wykazano, że ECC prawdopodobnie zostanie uznane za bardziej powszechne w grupach mniejszościowych w niekorzystnej sytuacji społecznej o niższych dochodach. Wcześniejsze badania przeprowadzone na obszarach o wysokim ryzyku próchnicy w Sztokholmie wskazują, że pochodzenie imigrantów, biorąc pod uwagę czynniki takie jak kultura, pochodzenie etniczne, styl życia, wzorca dietetyczna i praktyki higieny jamy ustnej, jest silnym predyktorem rozwoju ECC. Prowadzi to do hipotezy, że różnice w statusie karyologicznym można znaleźć w społeczno -ekonomicznie różnych społecznościach hrabstwa Sztokholmu, takich jak społeczności Danderyd i Järva.

Ponadto ślina została omówiona jako kluczowy modulator biologiczny, zaangażowany w utrzymanie zdrowia jamy ustnej. W oparciu o prostotę i nieinwazyjność pobierania próbek śliny, ostatnio wzrosło zainteresowanie wykorzystaniem tego złożonego płynu ustrojowego jako narzędzia diagnostycznego.

W kilku badaniach zbadano potencjalne zastosowanie białek ślinowych jako biomarkerów dla częstotliwości próchnicy i sugerowało korelacje między całkowite stężenie, a także charakter białek ślinowych i występowaniem próchnicy.

Ponadto stwierdzono silną korelację między wyższymi poziomami drobnoustrojów, takich jak Mutans Streptococci, Prevotella spp. I C. albicans, a zwiększoną częstością występowania próchnicy u dzieci przedszkolnych. Podczas gdy termin proteomika obejmuje badanie wszystkich białek z jednego gatunku, metaproteomika oparta na spektrometrii mas koncentruje się na scharakteryzowaniu białek społeczności bakteryjnych podczas interakcji z gospodarzem. W literaturze tylko ograniczona liczba badań dotyczyła metaprotomu próchnicy w biofilmach.

Jednak te odkrycia były zwykle obserwowane u młodzieży lub dorosłych, a brakuje badań interakcji między doustnym mikrobiomem a układem odpornościowym gospodarza u małych dzieci.

Zatem badanie to ma na celu rozszerzenie wiedzy o ludzkich i bakteryjnych cech metaproteomicznych w celu wdrożenia potencjalnych biomarkerów dla ECC, pomagania w zapobieganiu, ocenie ryzyka i terapii ECC.

Opis projektu

Ten międzydyscyplinarny projekt zostanie zrealizowany poprzez współpracę między Folktandvården w Sztokholmskim Landstinget (SLL) (Dr. Dr. Maria Anderson) i Department of Dental Medicine (KI) (Dr. Franziska Hetrodt i prof. Georgios Belibasakis). Ponadto część analityczna projektu będzie wspierana przez Proteomics Biomedicum Facility w kampusie KI Solna. Projekt zostanie wykonany w ramach klinicznej (etap 1) i części laboratoryjnej (etap 2). Przepływ pracy proteomicznej zostanie wykonywany zgodnie z ustalonymi protokołami.

Etap 1. Rekrutacja, badanie kliniczne i pobór próbek śliny Analiza mocy, oparta na dwustronnym teście F wariancji dla porównania dwóch grup (3-letnie dzieci proteomowe badane w folktandvården danderyd vs 3-letnia dzieci badane w folktandvården järva), z minimalnym efektem 2 (log2-leśne), minimalną siłę 80%, a znaczenie 5%i A i A i A i A I A IM i A I A I a I a. 10% nadwyżki, aby uwzględnić potencjalne porzucenia lub niekompletne dane, wykazało, że w obu grupach badawczych wymagana jest minimalna wielkość próby 50 uczestników.

Dzieci z ECC lub bez ECC zostaną rekrutowane w klinice Folktandvården w Järva i Danderyd. W szwedzkiej opiece zdrowotnej dentystycznej jest bezpłatna dla dzieci, a pierwsze badanie dentystyczne stanu zdrowia jamy ustnej odbywa się rutynowo w wieku trzech lat. Z tego powodu kliniki folktandvården w Sztokholmie organizują zdarzenia oceniające stan zdrowia jamy ustnej 3-letnich niemowląt. Jest to wyjątkowa okazja do zebrania i zbadania dużej grupy dzieci w tym samym wieku, a także porównywalnych czynników środowiskowych i społeczno-ekonomicznych.

Badacze dążą zatem na dwie kohorty badawcze składające się z samookreślonych populacji z skalibrowaną datą i godziną. Rekrutacja dwóch kohort badawczych będzie monitorowana przez dr Marię Anderson i dr Franziska Hetrodt. Pisemna świadoma zgoda zostanie uzyskana jako warunek wstępny do udziału w badaniu. Historia medyczna zostanie zabrana, a dzieci z chorobami dotkniętymi próchnicą, np. astma, zostanie zarejestrowana. Informacje demograficzne, takie jak seks, będą rejestrowane dla każdego uczestnika badania. Informacje o ogólnych chorobach, nawykach żywieniowych i szczotkowaniu zębów, a także czynnikach społeczno-kulturowych, takich jak język, pochodzenie etyczne, poziom wykształcenia rodziców itp. Zostaną rejestrowane za pomocą kwestionariusza.

Wszyscy pacjenci (n = 100) zostaną poproszeni o powstrzymanie się od jedzenia, picia i wszystkich procedur higieny jamy ustnej przez 2 godziny przed pobieraniem próbek. Pacjenci zostaną poproszeni o spłukanie ust wodą z kranu i oczekiwania na 5 minut, aby uniknąć rozcieńczenia próbki. Kolekcja śliny będzie wykonywana metodą zbierania śliny Swab [Salivabio Children's Swab (przedmiot nr 5001.06)]. W tym celu bawełniane swapy będą delikatnie przenoszone pod językiem, a następnie umieszczone w 15 ml sterylnych próbek i natychmiast w lodówce, aż do przeniesienia do zamrażarki -80 ° C w celu zera snapezowania. Czas między akwizycją próbki a zamrażaniem nie powinien przekraczać 30 minut, aby uniknąć uszkodzenia próbki. Każda próbka, która jest powiązana z zapisem pacjentów, zostanie podana unikalna kod identyfikacyjna. Przed analizą próbki śliny rozmrożono na lodzie, wirowano (4000 obr / min, 20 min, 4 ° C) w celu uzyskania supernatantów śliny i zamrożono w temperaturze -80 ° C ponownie do dalszego użycia. Standardowe badanie kliniczne każdego dziecka zostaną przeprowadzone po nabyciu próbek śliny przez skalibrowane egzaminatory (dentystów lub higienistek jamy ustnej). Kalibracja zostanie przeprowadzona z filmami klinicznymi i instrukcjami przed rekrutacją członków badania. Częstotliwość próchnicy zostanie zarejestrowana przez zepsute pominięte wypełnione zęby (DMFT) i połączone ICDA. Leczenie dentystyczne zostanie przeprowadzone jak wskazano. Zbieranie śliny, a także ocena dentysty i klasyfikacja ryzyka w czasopiśmie pacjentów T4 (CARESTREAM Dental) są wykonywane przez pracowników Folktandvården w Sztokholmie.

Etap 2. Profilowanie proteomu zebranej śliny próbki Analizy proteomiki o wysokiej przepustowości przeprowadzone w tym projekcie obejmują zarówno proteomikę gospodarza (białka ludzkie), jak i metaproteomika (białka wspólnotowe polimikrobialne). Analizy te wymagają połączenia wiedzy specjalistycznej i udogodnień dostarczanych w Ana Futura Laboratories w Campus Flemingsberg i Proteomics Biomedicum Facility w Campus Solna. Próbki śliny będą wstępnie uchwycone, a następnie przetworzone poprzez ilościową analizę proteomiczną bez etykiety. Stężenie białka próbek zostanie zmierzone, a następnie rozcieńczone do tej samej ilości (zwykle 20 µg/reakcja). W przypadku analizy proteomicznej z pojedynczą komórką masową pojedyncze komórki w 96-studzienkowych płytkach będą wysyłane do obiektu Biomedicum w Proteomice w Campus Solna i przeanalizowane w trybie obsługi zgodnie z ustalonymi procedurami. W skrócie, próbki najpierw ulegną ekstrakcji białka i trypsyny. Następnie próbki peptydów będą oznaczone za pomocą tandemowych odczynników masowych (TMT), suszonych, a następnie poddanych chromatografii cieczowej z analizą tandemowej spektrometrii masowej (LC-MS/MS). Nabyte dane proteomowe zostaną następnie opatrzone adnotacjami w stosunku do znanych baz danych białkowych, a wzorce regulacji białek i wzbogacenie szlaków między różnymi grupami badanymi zostaną ocenione.

Ogólna oś czasu

Jest to 3-roczny projekt zgodnie z następującymi krokami. Zastosowanie etyczne zostało zatwierdzone w jesieni 2024 r., A część kliniczna (etap 1) obejmuje rekrutację uczestników i pobieranie próbek na wiosnę 2025 r. Część laboratoryjna (etap 2), w tym analiza śliny, zostanie zainicjowana po zakończeniu etapu 1 (spadek 2025 r. - Fall 2026), aby zapewnić równe przetwarzanie wszystkich próbek. Analiza danych zostanie przeprowadzona, a wyniki zostaną opublikowane jesienią 2027 r.

Znaczenie

Wczesne próchnica jest poważnym problemem zdrowia jamy ustnej, dotykającej niemowlęta i dzieci w wieku przedszkolnym na całym świecie. Główne czynniki ryzyka w tworzeniu ECC można sklasyfikować jako czynniki ryzyka mikrobiologiczne, dietetyczne i środowiskowe, ponieważ wcześniej wykazano, że ECC występuje głównie w populacjach niekorzystnych społecznie. Po zdiagnozowaniu ECC dzieci prawdopodobnie będą wykazywać bardziej zaawansowany obraz kliniczny choroby w przyszłości. Jak dotąd rola mechanizmów molekularnych i przesłuchu gospodarza-mikrobiota u dzieciaków prądowych vs. wolnych od próchnicy, nie jest w pełni poznana. Wyniki tego projektu przyczynią się do lepszego zrozumienia pojawienia się sposobów molekularnych i pomogą ostatecznie zidentyfikować potencjalne cele terapeutyczne i biomarkery do diagnozy i zapobiegania przed wystąpieniem klinicznego objazdu choroby. Ponadto potencjalne salutogenne biomarkery można znaleźć u dzieci narażonych na wrażliwe środowisko, ale przeżywające próchnice wolne.