Pienten lasten sylkiproteiinien analyysi laitteena karieksen riskinarvioinnin parantamiseksi (DecodECC)

Projektiyhteenveto

Termi varhaislapsuuden karies (ECC) kuvaa yhden tai useamman rappeutuneen, kadonneiden (karies) tai täytettyjen ensisijaisten hampaiden esiintymisen kuuden vuoden ikäisillä lapsilla. On osoitettu, että ECC: n riskitekijät ovat usein sokerin kulutusta, riittämätöntä suuhygieniaa sekä kolonisaatiota kariogeenisten bakteerien kanssa, kuten mutans -streptokokkien ryhmä, jota pidetään lasten hampaiden rappeutumisen tärkeimpien etiologisten aineiden aineet. Muut bakteerit, kuten Prevotella spp. ja Lactobacillus spp., samoin kuin sieni Candida albicans, osoitettiin liittyvän ECC: n kehitykseen ja etenemiseen. Ihmisen syljen proteiinit voivat vaikuttaa oraalisten mikro -organismien elinkykyisyyteen erilaisilla luontaisilla puolustusmekanismeilla, mikä vaikuttaa siten suun mikroflooran koostumukseen. Samanaikaisesti bakteerit tuottavat proteiineja erilaisten prosessien parantamiseksi, esimerkiksi polysakkaridien tuotantoon. Vaikka sana proteomiikka kattaa kaikkien proteiinien tutkimuksen yhdestä lajista, metaproteomiikka liittyy mikrobiyhteisöjen proteiinien tutkimiseen vuorovaikutuksessa isännän kanssa, esim. Isäntä-mikrobiota Crosstalk. Kaiken kaikkiaan pienten lasten syljen proteiinikoostumus, olipa se mikrobista tai ihmisen alkuperästä, voisi auttaa biomarkkereiden toteuttamisessa varhaisessa diagnoosissa sekä ECC: n riskinarvioinnissa.

Tämän tutkimuksen tavoitteena on tutkia yleistä sylkiproteiinikoostumusta Ruotsin yhteisöjen 3-vuotiaiden lasten ryhmissä, joilla on erilainen ECC-riski, käyttämällä korkean suorituskyvyn proteomiaa.

Lyhyesti sanottuna 50 3-vuotiasta lasta rekrytoidaan kahteen julkiseen hammasterveydenhuollon keskukseen, Folktandvården Danderyd ja Folktandvården Järva. Hanke on rakennettu kliiniseen osaan (vaihe 1) ja analyyttiseen laboratorioosaan (vaihe 2). Vaihe 1 edellyttää potilaiden rekrytointia, syljen pyyhkäisynäytteiden keräämistä sekä kliinistä tutkimusta painottaen erityisesti ECC: n läsnäoloa. Vaihe 2 käsittää molekyylianalyyttisen osan, jonka aikana tapahtuu syljen proteominen karakterisointi. Tämä molekyylianalyyttinen osa suoritetaan Karolinska -instituutin hammaslääketieteen laitoksella vastaavien ydinlaitosten (skaalaamaton) tuella.

Tutkijat olettevat, että ECC: n vaikuttavilla lapsilla on erilaisia ​​isäntäproteomisia ja metaproteomisia sylkiprofiileja verrattuna karies-vapaita lapsia ja että nämä liittyvät jo tunnistettuihin riskeihin ECC: lle, joka on aiheutunut kahden yhteisön epätillisen kohortin välillä.

Tavoite

Projektin tavoitteena on hyödyntää proteomitekniikkaa syljen koostumuksen analysoimiseksi kahdessa 3-vuotiaan lapsen ryhmässä yhteisöistä, joilla on dokumentoituja karies-riskejä, tarkoituksena tunnistaa tulevaisuuden molekyylidiagnostiikka riski- ja terveyttä edistävät tekijät ECC: lle.

Perustutkimuskysymykset

• Voiko isäntäproteomi- ja metaproteomiprofiili (proteiinin ilmentyminen ja runsaus) osoittaa korrelaatiota tutkimuksen eri kohorttien yksilöiden keskuudessa?

Toissijainen tutkimuskysymykset

1. Kuinka kariesprofiili eroavat toisistaan ​​rekrytoitujen lasten kohorttien välillä Tukholman eri sosioekonomisesti karakterisoitujen yhteisöjen välillä?
2. Kuinka isännän proteomin ja metaproteomiprofiili eroavat karies-aiheutuneista ja kariesvapista lapsista?

3. Kuinka isännän proteomi- ja metaproteomiprofiili korreloi:

   • a) Haastattelukyselyissä käsitelty riskitekijät?
   • b) Karies -esiintyvyyden kliininen tila ja vakavuus?

Tutkijat olettavat, että ECC: n korkeampi esiintyvyys rekisteröidään Folktandvården Järvassa verrattuna folktandvården danderydiin ja että syljen koostumuksessa järjestetään proteomia (isäntä- ja mikrobia) vaihtelua kliinisen ja sosiologisen riskin tilan mukaan.

Tausta

Varhaislapsuuden karies (ECC) määritellään karieksi, joka löytyy esikouluikäisten lasten, ts. Alle 6-vuotiaiden lasten, ensisijaisesta hampaasta. Vaikka ennaltaehkäisevässä hammaslääketieteessä osoitettiin merkittäviä edistyksiä, ECC on edelleen tärkeä terveyskysymys monille lapsille ympäri maailmaa. Rajoitetusta edustavasta tiedoista huolimatta eri maiden raportit osoittavat, että ECC: n esiintyvyys 2–3 -vuotiailla lapsilla on yleensä 12–27%. On osoitettu, että ECC: tä löytyy todennäköisesti yleisemmästä sosiaalisesti heikommassa asemassa olevissa vähemmistöryhmissä, joilla on alhaisempi tulo. Aikaisemmat tutkimukset, jotka suoritetaan alueilla, joilla on suuri hammaskarieksen riski Tukholmassa, osoittavat, että maahanmuuttajien tausta, ottaen huomioon tekijät, kuten kulttuuri, etnisyys, elämäntapa, ruokavaliotapa ja suuhygieniakäytännöt, ovat vahva ennustaja ECC: n kehitykselle. Tämä johtaa hypoteesiin, jonka mukaan kariologisen aseman eroja löytyy Tukholman kreivikunnan sosioekonomisesti eri yhteisöistä, kuten Danderyd- ja Järva -yhteisöistä.

Lisäksi sylkeä on käsitelty ratkaisevana biologisena modulaattorina, joka on mukana suun terveyden ylläpitämisessä. Syljenäytteen keräyksen yksinkertaisuuden ja ei -invasiivisuuden perusteella on viime aikoina ollut yhä enemmän kiinnostusta tämän kompleksisen kehon nesteen käyttöön diagnostisena työkaluna.

Useissa tutkimuksissa on tutkittu sylkiproteiinien potentiaalista käyttöä biomarkkereina karieksen taajuuteen ja ehdottaneet korrelaatioita sekä sylkiproteiinien kokonaispitoisuuden että hammaskariesin esiintymisen välillä.

Lisäksi on havaittu voimakasta korrelaatiota korkeampien mikrobien, kuten mutans streptokokkien, Prevotella spp. Ja C. albicansin, välillä ja lisääntyneen karies -esiintyvyyden välillä esiopetuksen lapsilla. Vaikka termi proteomiikka sisältää kaikkien proteiinien tutkimuksen yhdestä lajista, massaspektrometriapohjainen metaproteomiikka keskittyy bakteeriyhteisöjen proteiinien karakterisointiin vuorovaikutuksessa isännän kanssa. Kirjallisuudessa vain rajoitettu määrä tutkimuksia on käsitelty hammaskarieksen metaproteomiin biofilmeissä.

Näitä havaintoja on kuitenkin tyypillisesti havaittu murrosikäisillä tai aikuisilla, ja oraalisen mikrobiomin vuorovaikutuksen ja pienten lasten isäntä -immuunijärjestelmän välisten vuorovaikutusten tutkimukset puuttuvat.

Siksi tämän tutkimuksen tavoitteena on laajentaa ihmisen ja bakteerien metaproteomisten ominaisuuksien tietämystä ECC: n mahdollisten biomarkkereiden toteuttamiseksi ennaltaehkäisyn, riskinarvioinnin ja ECC: n hoidon parantamiseksi.

Projektin kuvaus

Tämä poikkitieteellinen projekti toteutetaan Folktandvårdenin yhteistyössä Tukholman Läns Landstingetissä (SLL) (Dr. Maria Anderson) ja hammaslääketieteen laitos (KI) (Dr. Franziska Hetrodt ja prof. Georgios belibasakis). Lisäksi projektin analyyttistä osaa tukee Proteomics Biomedicum -laitos Ki Campus Solnassa. Tämä projekti suoritetaan kliinisessä (vaihe 1) ja laboratorioosassa (vaihe 2). Proteomiikan työnkulku suoritetaan vakiintuneiden protokollien mukaisesti.

Vaihe 1. Rekrytointi, kliininen tutkimus ja syljenäytteen kerääminen Pehoanalyysi, joka perustuu kaksisuuntaiseen F-varianssitestiin kahden ryhmän vertailussa (proteomien 3-vuotiaat lapset, joita tutkittiin Folktandvården Järvassa, 3-vuotiailla lapsilla, jotka tutkittiin Folktandvården Järvassa), jolla on vähimmäisvaikutus 2 (Log2-Fold-muutosten vähimmäiskoko), ja A: n vähimmäisvaikutusten kokous, ja A-arvon tasolla, ja A-arvon tasolla, ja A: n arvoinen taso), ja A-arvon tason vähimmäisvaikutus, ja A: n arvon pitoisuus, ja a. 10% ylimääräinen mahdollisten keskeyttäneiden tai puutteellisten tietojen huomioon ottamiseksi paljasti vähimmäisnäytteen koon 50 osallistujaa, joita tarvitaan molemmissa tutkimusryhmissä.

Lapset, joilla on ECC tai ilman sitä, rekrytoidaan Järvan ja Danderydin Folktandvården -klinikasta. Ruotsissa hammasterveydenhuolto on ilmainen lapsille, ja suun terveydentilan ensimmäinen hammaslääketieteellinen tutkimus suoritetaan rutiininomaisesti kolmen vuoden ikäisenä. Tästä syystä Tukholman Folktandvården-klinikat järjestävät tapahtumia, joissa arvioidaan 3-vuotiaiden vastasyntyneiden suun terveydentilaa. Tämä on ainutlaatuinen tilaisuus kerätä ja tutkia yhdessä kerralla suuria saman ikäisiä lapsiryhmiä sekä vertailukelpoisia ympäristö- ja sosioekonomisia tekijöitä.

Tutkijat pyrkivät siksi kahteen tutkimuskohorttiin, jotka koostuvat itse määrittelemistä populaatioista, joilla on kalibroitu päivämäärä ja aika. Kahden tutkimuskohortin rekrytointia seuraavat tohtori Maria Anderson ja tohtori Franziska Hetrodt. Kirjallinen tietoinen suostumus saadaan ennakkoedellytyksenä tutkimuksen osallistumiselle. Sairaushistoria otetaan ja lapset, joilla on karies-vaikuttavia sairauksia, esim. Astma, rekisteröidään. Jokaiselle tutkimuksen osallistujalle kirjataan väestötiedot, kuten sukupuoli. Tietoja yleisistä sairauksista, syömis- ja hampaiden harjaustottumuksista sekä sosiokulttuurisista tekijöistä, kuten kielestä, eettisestä taustasta, vanhempien koulutustasosta jne.

Kaikkia potilaita (n = 100) pyydetään pidättäytymään syömisestä, juomisesta ja kaikista suuhygieniamenetelmistä 2 tunnin ajan ennen näytteenottoa. Potilaita pyydetään huuhtelemaan suunsa vesijohtovedellä ja odottamaan 5 minuuttia näytteen laimennuksen välttämiseksi. Salivakokoelma suoritetaan Swab-pohjaisella syljen keräysmenetelmällä [Salivabio lasten swabi (esine nro 5001.06)]. Tätä varten puuvillan vaihtosopimukset siirretään varovasti kielen alle, asetetaan sitten 15 ml: n steriileihin näyteputkiin ja jäähdytetään välittömästi, kunnes ne siirretään -80 ° C: n pakastimeen napsautustapaamiseksi. Näytteen hankkimisen ja jäätymisen välinen aika ei saisi ylittää 30 minuuttia näytteen vaurioiden välttämiseksi. Jokaiselle näytteelle annetaan yksilöllinen ID -koodi, joka on kytketty potilaiden tietueeseen. Ennen analyysiä syljenäytteet sulattiin jäällä, sentrifugoitiin (4000 rpm, 20 min, 4 ° C) syljen supernatanttien saamiseksi ja jäädytettiin uudelleen -80 ° C: ssa edelleen, kunnes käyttöön Kunkin yksittäisen lapsen kliininen standarditutkimus suoritetaan syljenäytteiden hankkimisen jälkeen kalibroitujen tarkastajien (hammaslääkärit tai hammashesihygienistit). Kalibrointi suoritetaan kliinisillä videoilla ja ohjeilla ennen jäsenten rekrytointia. Karies -taajuus rekisteröidään rappeutuneiden täytettyjen hampaiden (DMFT) indeksin ja ICDA: n yhdistämällä. Hammashoito suoritetaan osoitetulla tavalla. Folktandvårdenin työntekijät Tukholman työntekijät suorittavat syljen kokoelman sekä hammasarvioinnin ja riskiluokituksen potilaan lehdessä T4 (Carestream Dental).

Vaihe 2. Kerättyjen syljen proteomiprofilointi Näytteet Tässä projektissa suoritetut korkeat suorituskykyproteomiikan analyysit sisältävät sekä isäntäproteomit (ihmisen proteiinit) että metaprotomian (polymikrobiset yhteisöproteiinit). Nämä analyysit tarvitsevat yhdistelmää Ana Futura Laboratories -yrityksessä Campus Flemingsbergissä ja Campus Solnan proteomiikan biomedicum -laitoksessa. Syljenäytteet käsitellään ja prosessoidaan sitten etikettivapaan kvantitatiivisella proteomianalyysillä. Näytteiden proteiinipitoisuus mitataan ja laimennetaan sitten samaan määrään (tyypillisesti 20 ug/reaktio). Massaspektrometristä yksisoluista proteomianalyysiä 96-kuoppalevyjen yksittäiset solut lähetetään Campus Solnan proteomiikan biomedicum-laitokseen ja analysoidaan käyttötilassa vakiintuneiden rutiinien mukaan. Lyhyesti sanottuna näytteille tehdään ensin proteiinien uutto ja trypsiini-digest. Sen jälkeen peptidinäytteet leimataan käyttämällä tandem-massan tag (TMT) -reagensseja, kuivataan ja sitten altistetaan nestekromatografia tandem-massaspektrometrialla (LC-MS/MS) -analyysi. Hankitut proteomitiedot merkitään sitten tunnettuihin proteiinitietokantoihin, ja proteiinien säätelykuviot ja reitin rikastukset eri tutkimusryhmien välillä arvioidaan.

Yleinen aikajana

Tämä on 3 vuoden projekti seuraavien vaiheiden mukaan. Eettinen hakemus hyväksyttiin syksyllä 2024 ja kliininen osa (vaihe 1), joka edellyttää osallistujien rekrytointia ja näytteen keräämistä, on suunniteltu keväälle 2025. Laboratorioosa (vaihe 2), mukaan lukien sylkiraarianalyysi, käynnistetään vaiheen 1 valmistumisen jälkeen (syksy 2025 - syksy 2026) kaikkien näytteiden yhtä suuren prosessoinnin varmistamiseksi. Tietoanalyysi suoritetaan, ja havainnot julkaistaan ​​syksyllä 2027.

Merkitys

Varhaislapsuuden karies on merkittävä suun terveysongelma, joka vaikuttaa vastasyntyneisiin ja esikoululapsiin ympäri maailmaa. Tärkeimmät riskitekijät ECC: n muodostumisessa voidaan luokitella mikrobiologisiksi, ruokavalio- ja ympäristöriskitekijöiksi, kuten aiemmin osoitettiin, että ECC esiintyy pääasiassa sosiaalisesti heikommassa asemassa olevissa populaatioissa. ECC: n diagnosoinnilla lapsilla on todennäköisesti edistyneempi kliininen kuva taudista tulevaisuudessa. Toistaiseksi molekyylimekanismien ja isäntä-mikrobiota-ylikuormituksen roolia karies-aktiivisissa vs. karies-vapaita lapsia ei ymmärretä täysin. Projektin tulokset vaikuttavat paremmin molekyylisten tapojen esiintymiseen ja auttavat lopulta tunnistamaan mahdolliset terapeuttiset kohteet ja biomarkkerit diagnoosiin ja ehkäisyyn ennen taudin kliinistä ilmenemismuotoa. Lisäksi mahdollisia salutogeenisiä biomarkkereita voitiin löytää lapsille, jotka ovat alttiina haavoittuvalle ympäristölle, mutta selvinnyt karies-vapaa.