Análise de proteínas salivares em crianças pequenas como dispositivo para melhorar a avaliação de risco de cárie (DecodECC)

Resumo do projeto

O termo cárie na primeira infância (ECC) descreve a presença de um ou mais dentes deteriorados, ausentes (devido a cárie) ou de dentes primários preenchidos em crianças de seis anos ou menos. Foi demonstrado que os fatores de risco para o ECC são frequentes consumo de açúcar, higiene oral inadequada, bem como a colonização com bactérias cariogênicas, como o grupo de estreptococos mutans, que são considerados os principais agentes etiológicos da cárie dentária em crianças. Outras bactérias, como Prevotella spp. e Lactobacillus spp., Assim como o fungo candida albicans, demonstraram estar associados ao desenvolvimento e progressão do ECC. As proteínas na saliva humana podem influenciar a viabilidade dos microorganismos orais por vários mecanismos de defesa inata, afetam assim a composição da microflora oral. Simultaneamente, as bactérias estão produzindo proteínas para melhorar vários processos, por exemplo, a produção de polissacarídeos. Enquanto a palavra proteômica cobre a exploração de todas as proteínas de uma espécie, a metaproteômica refere -se à investigação de proteínas de comunidades microbianas na interação com o host, por exemplo A fossa intermediária do host-microbiota. No geral, a composição da proteína na saliva das crianças pequenas, seja de origem microbiana ou humana, poderia ajudar na implementação de biomarcadores para diagnóstico precoce, bem como avaliação de riscos do ECC.

Este estudo tem como objetivo explorar a composição geral da proteína salivar em coortes de crianças de 3 anos de comunidades suecas de riscos variados de ECC, usando proteômica de alto rendimento.

Em resumo, 50 crianças de 3 anos serão recrutadas em dois centros de saúde públicos de saúde, Folktandvården Danderyd e Folktandvården Järva, respectivamente. O projeto é estruturado em uma parte clínica (estágio 1) e uma parte do laboratório analítico (estágio 2). O estágio 1 implicará o recrutamento de pacientes, a coleta de amostras de swab saliva e o exame clínico, com ênfase particular na presença de ECC. O estágio 2 compreende a parte analítica molecular durante a qual ocorrerá a caracterização proteômica da saliva. Essa parte analítica molecular será realizada no Departamento de Medicina Dental do Karolinska Institutet, com o apoio das respectivas instalações principais (sem escala).

Os investigadores levantam a hipótese de que existem perfis salivares proteômicos e metaproteômicos diferenciais do hospedeiro em crianças afetadas pelo ECC em comparação com crianças livres de cárie, e que estes estão associados a riscos já identificados para o ECC colocados entre as duas coortes de distinto da comunidade.

Propósito e objetivo

Este projeto tem como objetivo utilizar tecnologias proteômicas para analisar a composição da saliva em duas coortes de crianças de 3 anos de comunidades com riscos variados de cárie documentados, com o objetivo de identificar futuros fatores de promoção de riscos e promoções de saúde e saúde para a CEC.

Questões de pesquisa primária

• O proteoma do hospedeiro e o perfil de metaproteoma (expressão e abundância de proteínas) pode mostrar uma correlação com a prevalência de cárie entre indivíduos nas diferentes coortes do estudo?

Perguntas de pesquisa secundária

1. Como o perfil de cárie difere entre as coortes infantis recrutadas de diferentes comunidades socioeconomicamente caracterizadas em Estocolmo?
2. Como o proteoma e o perfil de metaproteoma do hospedeiro diferem entre crianças afetadas por cárie e livres de cárie?

3. Como o proteoma e o perfil metaproteoma do host se correlacionam com:

   • a) Fatores de risco abordados nos questionários de entrevistas?
   • b) O status clínico e a gravidade da prevalência de cárie?

Os investigadores levantam a hipótese de que uma maior prevalência de ECC será registrada no folktandvården järva, em comparação com o Folktandvården Danderyd e que haverá variações de proteoma (hospedeiro e microbiano) na composição salivar de acordo com os estatamentos de risco clínico e clínico.

Fundo

A cárie na primeira infância (ECC) é definida como cárie encontrada na dentição primária de crianças em idade pré-escolar, ou seja, crianças menores de 6 anos de idade. Embora os avanços significativos tenham sido mostrados na odontologia preventiva, o ECC continua sendo um grande problema de saúde para muitas crianças em todo o mundo. Apesar dos dados representativos limitados, relatórios de vários países mostram que a prevalência de ECC em crianças de 2 a 3 anos geralmente varia de 12% a 27%. Foi demonstrado que é provável que o ECC seja mais prevalente em grupos minoritários socialmente desfavorecidos com menor renda. Estudos anteriores realizados em áreas com alto risco de cárie dentária em Estocolmo indicam que um histórico de imigrantes, considerando fatores como cultura, etnia, estilo de vida, padrão alimentar e práticas de higiene bucal, é um forte preditor para o desenvolvimento do ECC. Isso leva à hipótese de que diferenças no status cariológico podem ser encontradas em comunidades socioeconomicamente diferentes do condado de Estocolmo, como as comunidades de Danderyd e Järva.

Além disso, a saliva foi discutida como um modulador biológico crucial, envolvido na manutenção da saúde bucal. Com base na simplicidade e não invasividade da coleta de amostras de saliva, houve recentemente um interesse crescente no uso desse complexo fluido corporal como ferramenta de diagnóstico.

Vários estudos exploraram o uso potencial de proteínas salivares como biomarcadores para a frequência da cárie e sugeriram correlações entre a concentração total e a natureza das proteínas salivares e a ocorrência de cárie dentária.

Além disso, foi encontrada uma forte correlação entre níveis mais altos de microbianos, como estreptococos mutans, Prevotella spp. E C. albicans e aumento da prevalência de cárie em crianças em idade pré -escolar. Embora o termo proteômica envolva o estudo de todas as proteínas de uma única espécie, a metaproteômica baseada em espectrometria de massa se concentra na caracterização de proteínas das comunidades bacterianas na interação com o hospedeiro. Na literatura, apenas um número limitado de estudos abordou o metaproteoma de cárie dentária em biofilmes.

No entanto, esses achados normalmente foram observados em adolescentes ou adultos, e faltam investigações das interações entre o microbioma oral e o sistema imunológico do hospedeiro em crianças pequenas.

Assim, este estudo tem como objetivo expandir o conhecimento das características metaproteômicas metaroteômicas humanas e bacterianas para implementar potenciais biomarcadores para o ECC, auxiliando em prevenção, avaliação de riscos e terapia para o ECC.

Descrição do projeto

Este projeto interdisciplinar será realizado através da colaboração entre Folktandvården no Läns Landstinget de Estocolmo (SLL) (Dr. Maria Anderson) e o Departamento de Medicina Dental (KI) (Dr. Franziska Hetrodt e Prof. Georgios Belibasakis). Além disso, a parte analítica do projeto será suportada pela instalação proteômica biomedicum no KI Campus Solna. Este projeto será realizado dentro de uma parte clínica (estágio 1) e de laboratório (estágio 2). O fluxo de trabalho proteômico será realizado de acordo com protocolos estabelecidos.

Stage 1. Recruitment, clinical examination, and saliva sample collection A power analysis, based on a two-tailed F test of variance for two-group comparison (proteome 3-year-old children examined in Folktandvården Danderyd vs 3-year-old children examined in Folktandvården Järva), with a minimum effect size of 2 (log2-fold changes), a minimum power of 80%, a significance level of 5%, and a O excesso de 10% para contabilizar possíveis abandonos ou dados incompletos revelou um tamanho mínimo da amostra de 50 participantes necessários nos dois grupos de estudo.

Crianças com ou sem ECC serão recrutadas na Clínica Folktandvården em Järva e Danderyd. Na Suécia, a saúde odontológica é gratuita para crianças, e o primeiro exame odontológico do estado de saúde bucal é realizado rotineiramente aos três anos de idade. Por esse motivo, as clínicas Folktandvården em Estocolmo organizam eventos que avaliam o estado de saúde oral de crianças de 3 anos de idade. Esta é uma oportunidade única de reunir e examinar em uma ocasião grandes grupos comunitários de crianças com a mesma idade, bem como fatores ambientais e socioeconômicos comparáveis.

Portanto, os pesquisadores buscam duas coortes de estudo que consistem em populações autodefinidas com data e hora calibradas. O recrutamento das duas coortes do estudo será monitorado pela Dra. Maria Anderson e pelo Dr. Franziska Hetrodt. O consentimento informado por escrito será obtido como pré -requisito para a participação no estudo. História médica será tomada e crianças com doenças afetadas por cárie, por exemplo, asma, será registrado. Informações demográficas como sexo serão registradas para cada participante do estudo. Informações sobre doenças gerais, hábitos de escovação para comer e dentes, bem como fatores socioculturais, como idioma, formação ética, nível de educação dos pais etc. serão registrados por meio de um questionário.

Todos os pacientes (n = 100) serão solicitados a se abster de comer, beber e todos os procedimentos de higiene bucal por 2 h antes da amostragem. Os pacientes serão solicitados a enxaguar a boca com água da torneira e aguardar 5 minutos para evitar a diluição da amostra. A coleção de saliva será realizada pelo método de coleta de saliva baseado em swab [swab infantil Salivabio (item nº 5001.06)]. Para isso, os swaps de algodão serão movidos suavemente sob a língua, depois colocados em tubos de amostra estéreis de 15 ml e imediatamente refrigerados até serem transferidos para o freezer a -80 ° C para congelamento. O tempo entre a aquisição de amostras e o congelamento não deve exceder 30 minutos para evitar danos à amostra. Um código de identificação exclusivo será fornecido a cada amostra vinculada ao registro dos pacientes. Antes da análise, as amostras de saliva foram descongeladas em gelo, centrifugadas (4000 rpm, 20 min, 4 ° C) para obter sobrenadantes da saliva e congelados a -80 ° C novamente até uso posterior. O exame padrão clínico de cada criança será realizado após a aquisição de amostras de saliva por examinadores calibrados (dentistas ou higienistas orais dentários). A calibração será realizada com vídeos e instruções clínicas antes do recrutamento de membros do estudo. A frequência de cárie será registrada pelo índice dentes preenchidos (DMFT) e ICDAs em decomposição. O tratamento odontológico será realizado conforme indicado. A coleta de saliva, bem como avaliação odontológica e classificação de risco no Patient Journal T4 (Carestream Dental), é realizada por funcionários da Folktandvården em Estocolmo.

Etapa 2. O perfil de proteoma das amostras de saliva coletadas As análises de alto rendimento da proteômica realizadas neste projeto incluem proteômica hospedeira (proteínas humanas) e metaproteômica (proteínas comunitárias polimicrobianas). Essas análises precisam da combinação da experiência e das instalações fornecidas nos laboratórios Ana Futura no campus Flemingsberg e nas instalações proteômicas biomedicum no campus Solna. As amostras de saliva serão pré-encaminhadas e depois processadas através de uma análise proteômica quantitativa sem rótulo. A concentração de proteínas das amostras será medida e depois diluída na mesma quantidade (normalmente 20 µg/reação). Para análise de proteômica de célula única espectrométrica de massa, células únicas em placas de 96 poços serão enviadas às instalações proteômicas biomedicum no campus solna e analisadas no modo de serviço de acordo com rotinas estabelecidas. Em resumo, as amostras serão submetidas a extração de proteínas e digestão de tripsina. Posteriormente, as amostras de peptídeos serão rotuladas usando reagentes de tag em tandem (TMT), secos e depois submetidos a cromatografia líquida com análise de espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). Os dados do proteoma adquiridos serão então anotados contra bancos de dados de proteínas conhecidos, e os padrões de regulação de proteínas e os enriquecimentos das via entre os diferentes grupos de estudo serão avaliados.

Linha do tempo geral

Este é um projeto de 3 anos de acordo com as etapas a seguir. A aplicação ética foi aprovada durante o outono de 2024 e a parte clínica (estágio 1) que implica o recrutamento de participantes e a coleta de amostras está planejada para a primavera de 2025. A parte do laboratório (estágio 2), incluindo a análise salivar, será iniciada após a conclusão do estágio 1 (outono de 2025 - outono de 2026) para garantir o processamento igual de todas as amostras. A análise dos dados será realizada e as descobertas serão publicadas no outono de 2027.

Significado

A cárie na primeira infância é um dos principais problemas de saúde bucal, afetando bebês e crianças em idade pré -escolar em todo o mundo. Os principais fatores de risco na formação de ECC podem ser categorizados como fatores de risco microbiológicos, alimentares e ambientais, pois foi demonstrado anteriormente que o ECC ocorre principalmente em populações socialmente desfavorecidas. Quando diagnosticados com ECC, as crianças provavelmente exibirão uma imagem clínica mais avançada da doença no futuro. Até agora, o papel dos mecanismos moleculares e a interferência de diafonia-microbiota em crianças ativas de cárie vs. livre de cárie não são totalmente compreendidas. Os resultados deste projeto contribuirão para uma melhor compreensão da aparência de maneiras moleculares e ajudarão a identificar possíveis alvos terapêuticos e biomarcadores para diagnóstico e prevenção antes da manifestação clínica da doença. Além disso, os potenciais biomarcadores salutogênicos podem ser encontrados para crianças expostas a um ambiente vulnerável, mas sobrevivendo à cárie livre.