Molekylær kultur til diagnosticering af neonatal sepsis

Nyfødte får ofte antibiotika ved mistanke om sepsis. Sepsis har høj morbiditet og dødelighed hos nyfødte. Omkring 5 % af alle nyfødte og over 85 % af meget for tidligt fødte børn modtager antibiotika empirisk. Postnatalt ordineres der ofte antibiotika til formodede bakterielle infektioner på neonatalafdelinger, men hos cirka 90-96 % af disse patienter er bakteriel infektion ikke påvist.

Hurtig diagnosticering af sepsis hos nyfødte er problematisk, fordi kliniske tegn starter subtile og er uspecifikke. Guldstandarden for diagnosticering af bakteriel neonatal sepsis er en konventionel blodkultur. Desværre er bakteriekultur tidskrævende (tid til resultat op til 36-72 timer) og mangler følsomhed i denne population. Af denne grund behandles nyfødte med risikofaktorer for infektion eller kliniske tegn og symptomer på infektion med antibiotika empirisk ved indledende mistanke om sepsis, afventende resultater af den konventionelle blodkultur. I øjeblikket modtager mere end 85 % af meget for tidligt fødte børn (svangerskabsalder <30 uger) antibiotika for risikoen for tidligt opstået sepsis i Holland.

Der er stigende evidens for, ud over antibiotikaresistens, at brugen af ​​antibiotika i den neonatale periode og i barndommen ændrer mikrobiomet med en øget risiko for umiddelbare og langsigtede bivirkninger, såsom øget risiko for astma, fedme, allergier og inflammatoriske sygdomme. tarmsygdomme (IBD). For at undgå unødvendig behandling af ikke-inficerede spædbørn vil en tidlig, hurtig, følsom og specifik laboratorietest være nyttig til at vejlede klinikere til at beslutte, hvornår de skal seponere antibiotika så hurtigt som muligt.

En lovende teknik til at opdage neonatal sepsis hurtigt og på et tidligere stadium sammenlignet med konventionel blodkultur er Molecular Culture (MC). MC er en avanceret, hurtig molekylærbaseret dyrkningsteknik, der er i stand til at identificere bakterier inden for 4 timer efter blodprøvetagning. Kort sagt er MC en DNA-baseret profileringsteknik, der differentierer mellem bakteriearter baseret på artsspecifikke forskelle i 16S-23S rDNA interspacer (IS) region nukleotidlængde ved at bruge phylum-specifikke fluorescensmærkede polymerasekædereaktion (PCR) primere. En standard IS-pro-procedure består af to separate PCR'er. I den første PCR tilføjes to forskellige primere, en primer, der fluorescerende mærker medlemmer af phyla Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria og Verrucomicrobia (FAFV), hvorimod den anden primer mærker medlemmer af Bacteroidetes phylum. I den anden PCR tilsættes en tredje mærket primer målrettet mod medlemmer af phylum Proteobacteria. Efterfølgende kan disse PCR-produkter amplificeres, og DNA-fragmenter kan separeres baseret på deres nukleotidlængde. Til sidst vil en typisk IS-pro mikrobiel profil blive skabt, bestående af et sæt farvemærkede toppe. Hver top repræsenterer en individuel bakteriel operationel taksonomisk enhed (OTU) afhængigt af nukleotidlængden af ​​IS-pro-fragmentet, længden af ​​disse toppe viser koncentrationen af ​​denne særlige OTU, hvorimod topfarver giver information om den nuværende phyla (FAFV, Bacteroidetes eller Proteobakterier). Figur 3 viser en skematisk fremstilling af konceptet for, hvordan IS-pro-proceduren fungerer.

Figur 3. Skematisk fremstilling af konceptet bag IS-pro-proceduren. (A) Alle bakteriearter indeholder mindst én IS-region i deres kromosom. Imidlertid indeholder mange arter flere alleler fra IS-regionen. Disse regioner kan variere mellem forskellige alleler. Afbildet her er den skematiske situation i E. faecalis, der indeholder fire alleler fra IS-regionen. To alleler har en længde på 275 nt, og de to andre har en længde på 377 nt. Ved amplifikation opnås en profil specifik for E. faecalis. (B) IS-profiler er meget forskellige mellem forskellige arter. Det faktum, at arter almindeligvis har flere alleler med forskellige længder, øger dramatisk differentialpotentialet mellem arter. (C) Ved at amplificere IS-fragmenter med phylum-specifikke fluorescensmærkede primere tilføjes et næste lag af information. (D) Når en IS-profil er lavet af en prøve, der indeholder flere arter fra forskellige phyla, findes toppe med forskellig længde, højde og farve. Disse svarer til arter, overflod og fylum. En topprofil kan oversættes til en liste over bakteriearter ved hjælp af en softwarealgoritme knyttet til en database med IS-profiler af kendte bakteriearter. Hele IS-pro-proceduren fra ubehandlet prøve til analyserede data kan udføres på 4 timer.

Ved bakteriel sepsis har en bakterie nået den ellers sterile blodbane, hvilket forårsager sepsis. Både blodkultur og MC kan påvise bakterier og give et positivt resultat (i tilfælde af at en bakterie er blevet dyrket) eller et negativt resultat (i tilfælde af at ingen bakterier blev påvist). Hvis testene er positive, viser begge teknikker også, hvilke bakterier der blev fundet, som kunne bruges til at ændre antibiotikakur for at målrette mod den specifikke dyrkede bakterier. Processen med MC kan dog afsluttes inden for 4 timer, hvilket er meget kortere end inkubationsperioden for guldstandardblodkulturen, som er 36-72 timer. Når der ikke er sepsis (og dermed ingen bakterier i blodbanen), vil MC vise sig negativt også inden for 4 timer og kan dermed guide klinikere til at stoppe antibiotika hos uinficerede spædbørn meget hurtigere sammenlignet med den konventionelle blodkultur.

Blodkulturer er stadig guldstandard, men antages generelt at have lav følsomhed for diagnosticering af sepsis hos nyfødte og er tidskrævende. Tilfælde af sepsis kan blive overset af kulturer, og en mere følsom diagnostisk test såsom molekylære tests som MC kan være nyttig. Fremskridt inden for mikrobiel teknologi har ført til udviklingen af ​​hurtige molekylære metoder, der kan være mere følsomme end kultur. Flere nye molekylære teknikker, såsom kvantitativ PCR, bred konventionel PCR og multiplex PCR, er blevet undersøgt for at påvise neonatal sepsis. Imidlertid er disse teknikker rettet mod specifikke arter, hvilket gør det umuligt at påvise alle bakteriearter. Alt, der ikke er eksplicit søgt efter, vil således blive savnet. I modsætning hertil havde MC evnen til at opdage enhver bakterieart, der kan forårsage bakteriel neonatal sepsis.

MC-teknikken er eksternt valideret til at påvise bakterier. En række artikler, der validerer alle aspekter af MC-teknikken, er blevet offentliggjort sidste år. Desuden bruges MC allerede på nogle hospitaler på intensivafdelingen til at påvise bakterier i ellers sterile prøver som blod, men også på prøver fra bylder. I en tidligere kohorte påviste efterforskerne fra denne forskningsgruppe, at MC kan være et nyttigt værktøj til at diagnosticere sepsis hos nyfødte ved hjælp af navlestrengsblod. Dette var dog en lille kohorte, og der er ikke udført store undersøgelser for at analysere MC's egnethed til at påvise bakteriel sepsis hos nyfødte.

Resultater fra andre undersøgelser, der bruger MC-teknikken til at påvise bakterier i menneskelig kropsvæske, er lovende. I en af ​​disse undersøgelser blev 66 prøver indsamlet og testet med konventionel kultur og MC. I 100 % af prøverne med en positiv kultur var MC også positiv. I fem prøver viste den konventionelle kultur sig at være negativ, mens MC var positiv. Casehistorierne for disse fem patienter blev indhentet og antydede, at MC-fundene var yderst klinisk relevante og derfor kan have højere følsomhed sammenlignet med konventionel blodkultur.

Sammenfattende gør den hurtige påvisning MC til en meget lovende teknik til at opdage sepsis hos nyfødte ved hjælp af navlestrengsblod. Imidlertid er egnetheden af ​​MC i denne specifikke population ikke tidligere blevet undersøgt. Derfor bør der udføres en stor undersøgelse af høj kvalitet for at bestemme den diagnostiske nøjagtighed af MC for sepsis hos nyfødte, der bruger navlestrengsblod.