Molekularkultur zur Diagnose der Neugeborenen-Sepsis

Neugeborene erhalten bei Verdacht auf Sepsis häufig Antibiotika. Sepsis hat eine hohe Morbidität und Mortalität bei Neugeborenen. Empirisch erhalten etwa 5 % aller Neugeborenen und über 85 % der sehr früh geborenen Säuglinge Antibiotika. Postnatal werden bei Verdacht auf bakterielle Infektionen auf Neugeborenenstationen oft Antibiotika verschrieben, aber bei ca. 90-96% dieser Patienten ist eine bakterielle Infektion nicht nachgewiesen.

Die schnelle Diagnose einer Sepsis bei Neugeborenen ist problematisch, da die klinischen Anzeichen subtil beginnen und unspezifisch sind. Der Goldstandard für die Diagnose einer bakteriellen Neugeborenensepsis ist eine konventionelle Blutkultur. Leider ist die Bakterienkultur zeitaufwändig (Zeit bis zum Ergebnis bis zu 36–72 Stunden) und in dieser Population nicht empfindlich. Aus diesem Grund werden Neugeborene mit Risikofaktoren für eine Infektion oder klinischen Anzeichen und Symptomen einer Infektion bei anfänglichem Sepsisverdacht empirisch mit Antibiotika behandelt, wobei die Ergebnisse der konventionellen Blutkultur abgewartet werden. Gegenwärtig erhalten in den Niederlanden mehr als 85 % der sehr frühgeborenen Säuglinge (Gestationsalter < 30 Wochen) Antibiotika wegen des Risikos einer früh einsetzenden Sepsis.

Abgesehen von Antibiotikaresistenzen gibt es zunehmend Hinweise darauf, dass die Verwendung von Antibiotika in der Neugeborenenzeit und während der Kindheit das Mikrobiom mit einem erhöhten Risiko für unmittelbare und langfristige Nebenwirkungen verändert, wie z. B. ein erhöhtes Risiko für Asthma, Fettleibigkeit, Allergien und Entzündungen Darmerkrankungen (CED). Um eine unnötige Behandlung von nicht infizierten Säuglingen zu vermeiden, wäre ein früher, schneller, sensitiver und spezifischer Labortest hilfreich, um Ärzte bei der Entscheidung zu unterstützen, wann Antibiotika so schnell wie möglich abgesetzt werden sollten.

Eine vielversprechende Technik, um Neugeborenensepsis schnell und in einem früheren Stadium im Vergleich zur herkömmlichen Blutkultur zu erkennen, ist die Molekularkultur (MC). MC ist eine fortschrittliche, schnelle molekularbasierte Kultivierungstechnik, mit der Bakterien innerhalb von 4 Stunden nach der Blutentnahme identifiziert werden können. Kurz gesagt, MC ist eine DNA-basierte Profilierungstechnik, die zwischen Bakterienarten basierend auf artspezifischen Unterschieden in der Nukleotidlänge der 16S-23S-rDNA-Interspacer (IS)-Region unterscheidet, indem stammspezifische fluoreszenzmarkierte Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Primer verwendet werden. Ein Standard-IS-pro-Verfahren besteht aus zwei getrennten PCRs. In der ersten PCR werden zwei verschiedene Primer hinzugefügt, wobei ein Primer Mitglieder der Phyla Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria und Verrucomicrobia (FAFV) fluoreszierend markiert, während der zweite Primer Mitglieder des Bacteroidetes-Stammes markiert. Bei der zweiten PCR wird ein dritter markierter Primer hinzugefügt, der auf Mitglieder des Stammes Proteobacteria abzielt. Anschließend können diese PCR-Produkte amplifiziert und DNA-Fragmente anhand ihrer Nukleotidlänge getrennt werden. Schließlich wird ein typisches IS-pro-Mikrobenprofil erstellt, das aus einer Reihe farblich gekennzeichneter Peaks besteht. Jeder Peak stellt eine individuelle bakterielle operative taxonomische Einheit (OTU) dar, abhängig von der Nukleotidlänge des IS-pro-Fragments, wobei die Länge dieser Peaks die Konzentration dieser bestimmten OTU zeigt, während die Peakfarben Informationen über die vorliegenden Phyla (FAFV, Bacteroidetes oder Proteobakterien). Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung des Konzepts, wie das IS-pro-Verfahren funktioniert.

Abbildung 3. Schematische Darstellung des Konzepts hinter dem IS-pro-Verfahren. (A) Alle Bakterienarten enthalten mindestens eine IS-Region in ihrem Chromosom. Viele Arten enthalten jedoch mehrere Allele der IS-Region. Diese Regionen können zwischen verschiedenen Allelen variieren. Hier ist die schematische Situation in E. faecalis dargestellt, die vier Allele der IS-Region enthält. Zwei Allele haben eine Länge von 275 nt, und die anderen beiden haben eine Länge von 377 nt. Bei der Amplifikation wird ein für E. faecalis spezifisches Profil erhalten. (B) IS-Profile sind zwischen verschiedenen Arten sehr unterschiedlich. Die Tatsache, dass Arten häufig mehrere Allele mit unterschiedlichen Längen haben, erhöht das unterschiedliche Potenzial zwischen Arten dramatisch. (C) Durch die Verstärkung von IS-Fragmenten mit stammspezifischen fluoreszenzmarkierten Primern wird eine nächste Informationsschicht hinzugefügt. (D) Wenn ein IS-Profil von einer Probe erstellt wird, die mehrere Arten aus verschiedenen Phyla enthält, werden Spitzen mit unterschiedlicher Länge, Höhe und Farbe gefunden. Diese entsprechen Art, Abundanz und Stamm. Ein Peakprofil kann durch einen Softwarealgorithmus, der mit einer Datenbank von IS-Profilen bekannter Bakterienarten verbunden ist, in eine Liste von Bakterienarten übersetzt werden. Das gesamte IS-pro-Verfahren von der unverarbeiteten Probe bis zu den analysierten Daten kann in 4 Stunden durchgeführt werden.

Bei der bakteriellen Sepsis gelangt ein Bakterium in den ansonsten sterilen Blutkreislauf und verursacht eine Sepsis. Sowohl Blutkultur als auch MC können Bakterien nachweisen und ein positives Ergebnis (falls Bakterien kultiviert wurden) oder ein negatives Ergebnis (falls keine Bakterien nachgewiesen wurden) liefern. Falls die Tests positiv sind, zeigen beide Techniken auch, welche Bakterien gefunden wurden, was verwendet werden könnte, um das Antibiotika-Regime zu ändern, um auf diese spezifischen kultivierten Bakterien abzuzielen. Der MC-Prozess kann jedoch innerhalb von 4 Stunden abgeschlossen werden, was viel kürzer ist als die Inkubationszeit der Goldstandard-Blutkultur, die 36-72 Stunden beträgt. Wenn keine Sepsis (und somit keine Bakterien im Blutkreislauf) vorliegt, wird die MC ebenfalls innerhalb von 4 Stunden negativ ausfallen und kann daher Ärzte dazu anleiten, Antibiotika bei nicht infizierten Säuglingen viel schneller abzusetzen als bei der herkömmlichen Blutkultur.

Blutkulturen sind nach wie vor Goldstandard, gelten aber allgemein als wenig sensitiv für die Sepsisdiagnostik bei Neugeborenen und sind zeitaufwändig. Fälle von Sepsis können durch Kulturen übersehen werden und ein empfindlicherer diagnostischer Test wie molekulare Tests als MC kann nützlich sein. Fortschritte in der mikrobiellen Technologie haben zur Entwicklung schneller molekularer Methoden geführt, die empfindlicher sein können als die Kultur. Mehrere neue molekulare Techniken, wie quantitative PCR, konventionelle Breitband-PCR und Multiplex-PCR, wurden untersucht, um neonatale Sepsis zu erkennen. Diese Techniken sind jedoch auf bestimmte Arten gerichtet, was es unmöglich macht, alle Bakterienarten nachzuweisen. Somit wird alles übersehen, wonach nicht explizit gesucht wird. Im Gegensatz dazu war MC in der Lage, jede Bakterienart nachzuweisen, die eine bakterielle neonatale Sepsis verursachen kann.

Die MC-Technik wurde extern zum Nachweis von Bakterien validiert. In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Artikeln veröffentlicht, die alle Aspekte der MC-Technik validieren. Darüber hinaus wird MC bereits in einigen Krankenhäusern auf der Intensivstation eingesetzt, um Bakterien in ansonsten sterilen Proben wie Blut, aber auch in Abszessproben nachzuweisen. In einer früheren Kohorte zeigten die Forscher dieser Forschungsgruppe, dass MC ein nützliches Instrument zur Diagnose von Sepsis bei Neugeborenen unter Verwendung von Nabelschnurblut sein kann. Dies war jedoch eine kleine Kohorte, und es wurden keine großen Studien durchgeführt, um die Eignung von MC zum Nachweis einer bakteriellen Sepsis bei Neugeborenen zu analysieren.

Ergebnisse aus anderen Studien, bei denen die MC-Technik zum Nachweis von Bakterien in menschlichen Körperflüssigkeiten eingesetzt wurde, sind vielversprechend. In einer dieser Studien wurden 66 Proben gesammelt und durch konventionelle Kultur und MC getestet. Bei 100 % der Proben mit positiver Kultur war auch der MC positiv. Bei fünf Proben erwies sich die herkömmliche Kultur als negativ, während die MC positiv war. Die Fallgeschichten dieser fünf Patienten wurden erhoben und deuteten darauf hin, dass die MC-Befunde von hoher klinischer Relevanz waren und daher im Vergleich zu herkömmlichen Blutkulturen eine höhere Sensitivität aufweisen könnten.

Zusammenfassend macht der schnelle Nachweis MC zu einer sehr vielversprechenden Methode, um eine Sepsis bei Neugeborenen anhand von Nabelschnurblut zu erkennen. Die Eignung von MC in dieser spezifischen Population wurde jedoch bisher nicht untersucht. Daher sollte eine große, qualitativ hochwertige Studie durchgeführt werden, um die diagnostische Genauigkeit der MC für Sepsis bei Neugeborenen unter Verwendung von Nabelschnurblut zu bestimmen.