Hodowla molekularna w diagnostyce sepsy noworodków

Noworodki często otrzymują antybiotyki z powodu podejrzenia sepsy. Sepsa charakteryzuje się wysoką chorobowością i śmiertelnością u noworodków. Około 5% wszystkich noworodków i ponad 85% niemowląt urodzonych bardzo przedwcześnie otrzymuje antybiotyki empirycznie. Po urodzeniu antybiotyki są często przepisywane na domniemane infekcje bakteryjne na oddziałach noworodkowych, ale u około 90-96% tych pacjentów zakażenie bakteryjne nie zostało potwierdzone.

Szybka diagnoza sepsy u noworodków jest problematyczna, ponieważ objawy kliniczne są początkowo subtelne i niespecyficzne. Złotym standardem w diagnostyce bakteryjnej posocznicy noworodków jest konwencjonalny posiew krwi. Niestety hodowla bakteryjna jest czasochłonna (czas oczekiwania na wynik do 36-72 godzin) i mało czuła w tej populacji. Z tego powodu noworodki z czynnikami ryzyka zakażenia lub objawami klinicznymi zakażenia są leczone antybiotykami empirycznie przy wstępnym podejrzeniu sepsy, w oczekiwaniu na wyniki konwencjonalnego posiewu krwi. Obecnie w Holandii ponad 85% noworodków urodzonych bardzo przedwcześnie (wiek ciążowy <30 tygodni) otrzymuje antybiotyki z powodu ryzyka wczesnej sepsy.

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że oprócz oporności na antybiotyki stosowanie antybiotyków w okresie noworodkowym i w dzieciństwie zmienia mikrobiom, zwiększając ryzyko natychmiastowych i długotrwałych działań niepożądanych, takich jak zwiększone ryzyko astmy, otyłości, alergii i stanów zapalnych. choroby jelit (IBD). Aby uniknąć niepotrzebnego leczenia niezakażonych niemowląt, pomocne byłoby wczesne, szybkie, czułe i swoiste badanie laboratoryjne, które pomogłoby klinicystom zdecydować, kiedy należy jak najszybciej przerwać antybiotykoterapię.

Obiecującą techniką szybkiego wykrywania sepsy noworodków na wcześniejszym etapie w porównaniu z konwencjonalnym posiewem krwi jest kultura molekularna (MC). MC to zaawansowana, szybka technika hodowli molekularnej, która jest w stanie zidentyfikować bakterie w ciągu 4 godzin po pobraniu krwi. W skrócie, MC jest techniką profilowania opartą na DNA, różnicującą gatunki bakterii w oparciu o specyficzne dla gatunku różnice w długości nukleotydów regionu międzyprzerywnikowego (IS) 16S-23S rDNA za pomocą specyficznych dla typu, znakowanych fluorescencyjnie starterów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Standardowa procedura IS-pro składa się z dwóch oddzielnych PCR. W pierwszej reakcji PCR dodaje się dwa różne startery, jeden fluorescencyjnie znakujący członków rodzaju Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria i Verrucomicrobia (FAFV), podczas gdy drugi starter znakuje członków rodzaju Bacteroidetes. W drugim PCR dodawany jest trzeci znakowany starter ukierunkowany na członków typu Proteobacteria. Następnie te produkty PCR można amplifikować i rozdzielać fragmenty DNA na podstawie ich długości nukleotydowej. Ostatecznie zostanie utworzony typowy profil mikrobiologiczny IS-pro, składający się z zestawu pików oznaczonych kolorami. Każdy pik reprezentuje indywidualną operacyjną jednostkę taksonomiczną bakterii (OTU) w zależności od długości nukleotydu fragmentu IS-pro, długość tych pików świadczy o koncentracji tego konkretnego OTU, natomiast kolory pików dostarczają informacji o obecnym typie (FAFV, Bacteroidetes lub Proteobakterie). Rysunek 3 przedstawia schematyczną reprezentację koncepcji działania procedury IS-pro.

Rycina 3. Schematyczne przedstawienie koncepcji procedury IS-pro. (A) Wszystkie gatunki bakterii zawierają co najmniej jeden region IS w swoim chromosomie. Jednak wiele gatunków zawiera allele wielokrotne regionu IS. Regiony te mogą różnić się między różnymi allelami. Przedstawiono tutaj schematyczną sytuację w E. faecalis, która zawiera cztery allele regionu IS. Dwa allele mają długość 275 nt, a dwa pozostałe mają długość 377 nt. Po amplifikacji uzyskuje się profil specyficzny dla E. faecalis. (B) Profile IS są bardzo zróżnicowane między różnymi gatunkami. Fakt, że gatunki zwykle mają wiele alleli o różnej długości, dramatycznie zwiększa potencjał różnicowy między gatunkami. (C) Poprzez amplifikację fragmentów IS za pomocą starterów znakowanych fluorescencyjnie specyficznych dla typów, dodawana jest kolejna warstwa informacji. (D) Kiedy profil IS jest tworzony z próbki zawierającej wiele gatunków z różnych typów, znajdują się piki o różnej długości, wysokości i kolorze. Odpowiadają one gatunkowi, liczebności i typowi. Profil pików można przetłumaczyć na listę gatunków bakterii za pomocą algorytmu oprogramowania połączonego z bazą danych profili IS znanych gatunków bakterii. Całą procedurę IS-pro od nieprzetworzonej próbki do analizowanych danych można wykonać w 4 godziny.

W posocznicy bakteryjnej bakteria dotarła do sterylnego krwioobiegu, powodując posocznicę. Zarówno posiew krwi, jak i MC mogą wykryć bakterie i dać wynik pozytywny (w przypadku hodowli bakterii) lub wynik negatywny (w przypadku braku bakterii). W przypadku pozytywnego wyniku testu obie techniki pokazują również, które bakterie zostały wykryte, co można wykorzystać do zmiany schematu antybiotykoterapii w celu ukierunkowania na tę konkretną hodowaną bakterię. Jednak proces MC można zakończyć w ciągu 4 godzin, czyli znacznie krócej niż okres inkubacji złotego standardowego posiewu krwi, który wynosi 36-72 godzin. Gdy nie ma posocznicy (a tym samym bakterii w krwiobiegu), MC okaże się ujemna również w ciągu 4 godzin, co może pomóc klinicystom w znacznie szybszym zaprzestaniu podawania antybiotyków niezakażonym niemowlętom w porównaniu z konwencjonalnym posiewem krwi.

Posiewy krwi są nadal złotym standardem, ale ogólnie przyjmuje się, że mają niską czułość w diagnostyce sepsy u noworodków i są czasochłonne. Przypadki sepsy mogą zostać pominięte przez hodowle i bardziej czuły test diagnostyczny, taki jak testy molekularne, jako MC, może być przydatny. Postępy w technologii mikrobiologicznej doprowadziły do ​​opracowania szybkich metod molekularnych, które mogą być bardziej czułe niż hodowla. Zbadano wiele nowych technik molekularnych, takich jak ilościowy PCR, konwencjonalny PCR o szerokim zakresie i multipleksowy PCR, w celu wykrycia posocznicy noworodków. Techniki te są jednak ukierunkowane na określone gatunki, co uniemożliwia wykrycie wszystkich gatunków bakterii. W ten sposób wszystko, co nie zostanie wyraźnie wyszukane, zostanie pominięte. Natomiast MC miał możliwość wykrycia każdego gatunku bakterii, który może wywołać bakteryjną posocznicę noworodków.

Technika MC została zweryfikowana zewnętrznie pod kątem wykrywania bakterii. W ostatnich latach opublikowano serię artykułów potwierdzających wszystkie aspekty techniki MC. Co więcej, MC jest już używany w niektórych szpitalach na oddziałach intensywnej terapii do wykrywania bakterii w sterylnych próbkach, takich jak krew, ale także w próbkach pobranych z ropni. W poprzedniej kohorcie badacze z tej grupy badawczej wykazali, że MC może być użytecznym narzędziem do diagnozowania sepsy u noworodków przy użyciu krwi pępowinowej. Była to jednak mała kohorta i nie przeprowadzono dużych badań w celu analizy przydatności MC w wykrywaniu posocznicy bakteryjnej u noworodków.

Obiecujące są wyniki innych badań wykorzystujących technikę MC do wykrywania bakterii w płynach ustrojowych człowieka. W jednym z tych badań zebrano 66 próbek i przebadano je za pomocą konwencjonalnej kultury i MC. W 100% próbek z kulturą dodatnią MC było również dodatnie. W pięciu próbkach kultura konwencjonalna okazała się negatywna, podczas gdy MC była pozytywna. Uzyskano historie przypadków tych pięciu pacjentów i zasugerowano, że wyniki MC były wysoce istotne klinicznie, a zatem mogą mieć wyższą czułość w porównaniu z konwencjonalnym posiewem krwi.

Podsumowując, szybkie wykrywanie sprawia, że ​​MC jest bardzo obiecującą techniką wykrywania sepsy u noworodków przy użyciu krwi pępowinowej. Jednak przydatność MC w tej konkretnej populacji nie była wcześniej badana. Dlatego należy przeprowadzić duże, wysokiej jakości badanie w celu określenia dokładności diagnostycznej MC w przypadku sepsy u noworodków przy użyciu krwi pępowinowej.