Cultura molecolare per la diagnosi di sepsi neonatale

I neonati spesso ricevono antibiotici per un sospetto di sepsi. La sepsi ha un'elevata morbilità e mortalità nei neonati. Circa il 5% di tutti i neonati e oltre l'85% dei nati molto prematuri ricevono antibiotici empiricamente. Dopo la nascita, gli antibiotici sono spesso prescritti per presunte infezioni batteriche nei reparti neonatali, ma in circa il 90-96% di questi pazienti l'infezione batterica non è provata.

La diagnosi rapida di sepsi nei neonati è problematica perché i segni clinici iniziano in modo sottile e non sono specifici. Il gold standard per la diagnosi di sepsi neonatale batterica è un'emocoltura convenzionale. Sfortunatamente, la coltura batterica richiede molto tempo (tempo per ottenere risultati fino a 36-72 ore) e manca di sensibilità in questa popolazione. Per questo motivo, i neonati con fattori di rischio di infezione o segni e sintomi clinici di infezione vengono trattati empiricamente con antibiotici al sospetto iniziale di sepsi, in attesa dei risultati dell'emocoltura convenzionale. Attualmente oltre l'85% dei neonati molto pretermine (età gestazionale <30 settimane) riceve antibiotici per il rischio di sepsi ad esordio precoce nei Paesi Bassi.

Vi è una crescente evidenza che, a parte la resistenza agli antibiotici, l'uso di antibiotici nel periodo neonatale e durante l'infanzia altera il microbioma con un aumento del rischio di effetti avversi immediati e a lungo termine, come un aumento del rischio di asma, obesità, allergie e infiammazione malattie intestinali (IBD). Per evitare il trattamento non necessario di neonati non infetti, un test di laboratorio precoce, rapido, sensibile e specifico sarebbe utile per guidare i medici a decidere quando interrompere gli antibiotici il prima possibile.

Una tecnica promettente per rilevare la sepsi neonatale rapidamente e in una fase precedente rispetto all'emocoltura convenzionale è la coltura molecolare (MC). MC è una tecnica di coltura molecolare avanzata e rapida in grado di identificare i batteri entro 4 ore dal prelievo di sangue. In breve, MC è una tecnica di profilazione basata sul DNA, che differenzia tra specie batteriche in base a differenze specie-specifiche nella lunghezza del nucleotide della regione dell'interspaziatore rDNA 16S-23S (IS) utilizzando primer di reazione a catena della polimerasi (PCR) con etichetta fluorescente specifica per phylum. Una procedura IS-pro standard consiste in due PCR separate. Nella prima PCR vengono aggiunti due diversi primer, un primer che etichetta in modo fluorescente i membri del phyla Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria e Verrucomicrobia (FAFV), mentre il secondo primer etichetta i membri del phylum Bacteroidetes. Nella seconda PCR, viene aggiunto un terzo primer marcato mirato ai membri del phylum Proteobacteria. Successivamente, questi prodotti di PCR possono essere amplificati e i frammenti di DNA possono essere separati in base alla loro lunghezza nucleotidica. Alla fine, verrà creato un tipico profilo microbico IS-pro, costituito da una serie di picchi etichettati a colori. Ogni picco rappresenta una singola unità tassonomica operativa batterica (OTU) a seconda della lunghezza nucleotidica del frammento IS-pro, la lunghezza di questi picchi dimostra la concentrazione di questa particolare OTU, mentre i colori dei picchi forniscono informazioni sui phyla presenti (FAFV, Bacteroidetes o proteobatteri). La Figura 3 mostra una rappresentazione schematica del concetto di funzionamento della procedura IS-pro.

Figura 3. Rappresentazione schematica del concetto alla base della procedura IS-pro. (A) Tutte le specie batteriche contengono almeno una regione IS nel loro cromosoma. Tuttavia, molte specie contengono più alleli della regione IS. Queste regioni possono variare tra diversi alleli. Qui è rappresentata la situazione schematica in E. faecalis che contiene quattro alleli della regione IS. Due alleli hanno una lunghezza di 275 nt e gli altri due hanno una lunghezza di 377 nt. Quando amplificato, si ottiene un profilo specifico per E. faecalis. (B) I profili IS sono molto diversi tra le diverse specie. Il fatto che le specie abbiano comunemente più alleli con lunghezze diverse aumenta notevolmente il potenziale differenziale tra le specie. (C) Amplificando i frammenti IS con primer marcati con fluorescenza specifici del phylum, viene aggiunto un livello successivo di informazioni. (D) Quando un profilo IS è costituito da un campione contenente più specie di diversi phyla, vengono trovati picchi con diverse lunghezze, altezza e colore. Questi corrispondono a specie, abbondanza e phylum. Un profilo di picco può essere tradotto in un elenco di specie batteriche mediante un algoritmo software collegato a un database di profili IS di specie batteriche note. L'intera procedura IS-pro dal campione non elaborato ai dati analizzati può essere eseguita in 4 h.

Nella sepsi batterica, un batterio ha raggiunto il flusso sanguigno altrimenti sterile causando la sepsi. Sia l'emocoltura che la MC possono rilevare i batteri e dare un risultato positivo (nel caso in cui un batterio sia stato coltivato) o un risultato negativo (nel caso in cui non sia stato rilevato alcun batterio). Nel caso in cui i test siano positivi, entrambe le tecniche mostrano anche quale batterio è stato trovato, che potrebbe essere utilizzato per modificare il regime antibiotico per colpire quello specifico batterio in coltura. Tuttavia, il processo di MC può essere completato entro 4 ore, che è molto più breve del periodo di incubazione dell'emocoltura gold standard che è di 36-72 ore. Quando non c'è sepsi (e quindi nessun batterio nel flusso sanguigno), il MC risulterà negativo anche entro 4 ore e quindi può guidare i medici a interrompere gli antibiotici nei neonati non infetti molto più velocemente rispetto all'emocoltura convenzionale.

Le emocolture sono ancora il gold standard, ma generalmente si presume che abbiano una bassa sensibilità per la diagnosi di sepsi nei neonati e richiedano molto tempo. I casi di sepsi possono essere ignorati dalle colture e può essere utile un test diagnostico più sensibile come i test molecolari come il MC. I progressi nella tecnologia microbica hanno portato allo sviluppo di metodi molecolari rapidi, che possono essere più sensibili della coltura. Molteplici nuove tecniche molecolari, come la PCR quantitativa, la PCR convenzionale ad ampio raggio e la PCR multiplex, sono state studiate per rilevare la sepsi neonatale. Tuttavia, queste tecniche sono dirette a specie specifiche, il che rende impossibile rilevare tutte le specie batteriche. Pertanto, tutto ciò che non viene cercato in modo esplicito verrà perso. Al contrario, MC aveva la capacità di rilevare ogni specie batterica che può causare sepsi neonatale batterica.

La tecnica MC è stata convalidata esternamente per rilevare i batteri. Negli ultimi anni è stata pubblicata una serie di documenti che convalidano tutti gli aspetti della tecnica MC. Inoltre, MC è già utilizzato in alcuni ospedali dell'unità di terapia intensiva per rilevare i batteri in campioni altrimenti sterili come il sangue, ma anche su campioni ottenuti da ascessi. In una coorte precedente, i ricercatori di questo gruppo di ricerca hanno dimostrato che la MC può essere uno strumento utile per diagnosticare la sepsi nei neonati utilizzando il sangue del cordone ombelicale. Tuttavia, questa era una piccola coorte e non sono stati condotti studi di grandi dimensioni per analizzare l'idoneità della MC nel rilevare la sepsi batterica nei neonati.

I risultati di altri studi che utilizzano la tecnica MC per rilevare i batteri nel fluido corporeo umano sono promettenti. In uno di questi studi sono stati raccolti e testati 66 campioni mediante coltura convenzionale e MC. Nel 100% dei campioni con coltura positiva, anche il MC è risultato positivo. In cinque campioni, la coltura convenzionale è risultata negativa, mentre la MC è risultata positiva. Le anamnesi di questi cinque pazienti sono state ottenute e hanno suggerito che i risultati del MC erano altamente rilevanti dal punto di vista clinico e quindi potrebbero avere una sensibilità maggiore rispetto all'emocoltura convenzionale.

In sintesi, il rilevamento rapido rende MC una tecnica molto promettente per rilevare la sepsi nei neonati utilizzando il sangue del cordone ombelicale. Tuttavia, l'idoneità di MC in questa specifica popolazione non è stata studiata in precedenza. Pertanto, dovrebbe essere eseguito uno studio ampio e di alta qualità per determinare l'accuratezza diagnostica della MC per la sepsi nei neonati utilizzando il sangue del cordone ombelicale.