Molekulární kultivace pro diagnostiku novorozenecké sepse

Novorozenci často dostávají antibiotika pro podezření na sepsi. Sepse má vysokou morbiditu a mortalitu u novorozenců. Přibližně 5 % všech novorozenců a více než 85 % velmi předčasně narozených dětí dostává antibiotika empiricky. Postnatálně jsou antibiotika často předepisována na předpokládané bakteriální infekce na novorozeneckých odděleních, ale přibližně u 90–96 % těchto pacientů není bakteriální infekce prokázána.

Rychlá diagnostika sepse u novorozenců je problematická, protože klinické příznaky začínají nenápadně a jsou nespecifické. Zlatým standardem pro diagnostiku bakteriální neonatální sepse je konvenční hemokultura. Bakteriální kultivace je bohužel časově náročná (doba do dosažení výsledku až 36–72 hodin) a v této populaci postrádá citlivost. Z tohoto důvodu jsou novorozenci s rizikovými faktory pro infekci nebo s klinickými příznaky a symptomy infekce léčeni antibiotiky empiricky při počátečním podezření na sepsi a čekají na výsledky konvenční hemokultury. V současné době více než 85 % velmi předčasně narozených dětí (gestační věk <30 týdnů) dostává v Nizozemsku antibiotika pro riziko časné sepse.

Přibývá důkazů, že kromě rezistence na antibiotika mění používání antibiotik v novorozeneckém období a během dětství mikrobiom se zvýšeným rizikem okamžitých a dlouhodobých nežádoucích účinků, jako je zvýšené riziko astmatu, obezity, alergií a zánětlivých onemocnění. onemocnění střev (IBD). Aby se předešlo zbytečné léčbě neinfikovaných kojenců, pomohl by včasný, rychlý, citlivý a specifický laboratorní test lékařům, aby se rozhodli, kdy antibiotika co nejdříve vysadit.

Slibnou technikou pro rychlou detekci novorozenecké sepse a v časnějším stadiu ve srovnání s konvenční hemokulturou je Molecular Culture (MC). MC je pokročilá, rychlá molekulární kultivační technika, která je schopna identifikovat bakterie do 4 hodin po odběru krve. Stručně řečeno, MC je technika profilování založená na DNA, která rozlišuje mezi bakteriálními druhy na základě druhově specifických rozdílů v délce nukleotidů 16S-23S rDNA interspacer (IS) oblasti pomocí kmenově specifických fluorescenčně značených primerů polymerázové řetězové reakce (PCR). Standardní postup IS-pro se skládá ze dvou samostatných PCR. V první PCR jsou přidány dva různé primery, jeden primer fluorescenčně značící členy kmene Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria a Verrucomicrobia (FAFV), zatímco druhý primer označuje členy kmene Bacteroidetes. Ve druhé PCR je přidán třetí značený primer zacílený na členy kmene Proteobacteria. Následně mohou být tyto produkty PCR amplifikovány a fragmenty DNA mohou být separovány na základě jejich délky nukleotidů. Nakonec dojde k vytvoření typického mikrobiálního profilu IS-pro, který se skládá ze sady barevně označených píků. Každý pík představující individuální bakteriální operační taxonomickou jednotku (OTU) v závislosti na délce nukleotidu fragmentu IS-pro, délka těchto píku demonstruje koncentraci tohoto konkrétního OTU, zatímco barvy píku poskytují informace o přítomném kmeni (FAFV, Bacteroidetes nebo Proteobakterie). Obrázek 3 ukazuje schematické znázornění konceptu, jak funguje procedura IS-pro.

Obrázek 3. Schematické znázornění konceptu procedury IS-pro. (A) Všechny bakteriální druhy obsahují ve svém chromozomu alespoň jednu oblast IS. Mnoho druhů však obsahuje více alel oblasti IS. Tyto oblasti se mohou mezi různými alelami lišit. Zde je znázorněna schematická situace u E. faecalis, která obsahuje čtyři alely oblasti IS. Dvě alely mají délku 275 nt a další dvě mají délku 377 nt. Po amplifikaci se získá profil specifický pro E. faecalis. (B) Profily IS jsou mezi různými druhy velmi různorodé. Skutečnost, že druhy běžně mají více alel s různou délkou, dramaticky zvyšuje rozdílný potenciál mezi druhy. (C) Amplifikace fragmentů IS s kmenově specifickými fluorescenčně značenými primery je přidána další vrstva informací. (D) Když je profil IS vytvořen ze vzorku obsahujícího více druhů z různých kmenů, jsou nalezeny píky s různou délkou, výškou a barvou. Ty odpovídají druhům, hojnosti a kmeni. Profil píku může být převeden na seznam bakteriálních druhů softwarovým algoritmem propojeným s databází IS profilů známých bakteriálních druhů. Celý proces IS-pro od nezpracovaného vzorku po analyzovaná data lze provést za 4 hodiny.

Při bakteriální sepsi se bakterie dostala do jinak sterilního krevního řečiště a způsobila sepsi. Jak hemokultura, tak MC mohou detekovat bakterie a poskytnout pozitivní výsledek (v případě, že byla bakterie kultivována) nebo negativní výsledek (v případě, že nebyly zjištěny žádné bakterie). V případě, že jsou testy pozitivní, obě techniky také ukazují, které bakterie byly nalezeny, což by mohlo být použito ke změně antibiotického režimu tak, aby cílil na konkrétní kultivované bakterie. Proces MC však může být ukončen do 4 hodin, což je mnohem kratší doba než inkubační doba zlatého standardu hemokultury, která je 36-72 hodin. Pokud nedojde k sepsi (a tedy žádné bakterie v krevním řečišti), bude MC negativní také do 4 hodin, a tak může klinické lékaře vést k vysazení antibiotik u neinfikovaných kojenců mnohem rychleji ve srovnání s konvenční hemokulturou.

Hemokultury jsou stále zlatým standardem, ale obecně se předpokládá, že mají nízkou senzitivitu pro diagnostiku sepse u novorozenců a jsou časově náročné. Případy sepse mohou kultivace přehlédnout a může být užitečný citlivější diagnostický test, jako jsou molekulární testy jako MC. Pokroky v mikrobiální technologii vedly k vývoji rychlých molekulárních metod, které mohou být citlivější než kultivace. Pro detekci neonatální sepse bylo studováno mnoho nových molekulárních technik, jako je kvantitativní PCR, širokopásmová konvenční PCR a multiplexní PCR. Tyto techniky jsou však zaměřeny na specifické druhy, což znemožňuje detekci všech bakteriálních druhů. Tedy vše, co není vysloveně hledáno, bude chybět. Naproti tomu MC měla schopnost detekovat každý bakteriální druh, který může způsobit bakteriální neonatální sepsi.

Technika MC byla externě ověřena pro detekci bakterií. V minulých letech byla publikována řada článků ověřujících všechny aspekty techniky MC. Kromě toho se MC již používá v některých nemocnicích na jednotce intenzivní péče k detekci bakterií v jinak sterilních vzorcích, jako je krev, ale také ve vzorcích získaných z abscesů. V předchozí kohortě výzkumníci z této výzkumné skupiny prokázali, že MC může být užitečným nástrojem pro diagnostiku sepse u novorozenců pomocí pupečníkové krve. Jednalo se však o malou kohortu a nebyly provedeny žádné velké studie k analýze vhodnosti MC při detekci bakteriální sepse u novorozenců.

Slibné jsou výsledky dalších studií využívajících techniku ​​MC k detekci bakterií v lidské tělesné tekutině. V jedné z těchto studií bylo odebráno a testováno 66 vzorků konvenční kulturou a MC. U 100 % vzorků s pozitivní kulturou byla pozitivní i MC. U pěti vzorků se konvenční kultura ukázala jako negativní, zatímco MC byla pozitivní. Byly získány anamnézy těchto pěti pacientů a naznačovaly, že nálezy MC byly vysoce klinicky relevantní, a proto mohou mít vyšší senzitivitu ve srovnání s konvenční hemokulturou.

Stručně řečeno, rychlá detekce dělá z MC velmi slibnou techniku ​​pro detekci sepse u novorozenců pomocí pupečníkové krve. Vhodnost MC v této specifické populaci však nebyla dříve zkoumána. Proto by měla být provedena rozsáhlá, vysoce kvalitní studie ke stanovení diagnostické přesnosti MC pro sepsi u novorozenců pomocí pupečníkové krve.