Culture moléculaire pour le diagnostic du sepsis néonatal

Les nouveau-nés reçoivent souvent des antibiotiques en cas de suspicion de septicémie. La septicémie a une morbidité et une mortalité élevées chez les nouveau-nés. Environ 5 % de tous les nouveau-nés et plus de 85 % des nourrissons très prématurés reçoivent des antibiotiques de manière empirique. Après la naissance, des antibiotiques sont souvent prescrits pour des infections bactériennes présumées dans les services de néonatologie, mais chez environ 90 à 96 % de ces patients, l'infection bactérienne n'est pas prouvée.

Le diagnostic rapide de la septicémie chez les nouveau-nés est problématique car les signes cliniques commencent subtils et ne sont pas spécifiques. L'étalon-or pour le diagnostic de la septicémie bactérienne néonatale est une hémoculture conventionnelle. Malheureusement, la culture bactérienne prend du temps (temps d'obtention du résultat jusqu'à 36 à 72 heures) et manque de sensibilité dans cette population. Pour cette raison, les nouveau-nés présentant des facteurs de risque d'infection ou des signes cliniques et des symptômes d'infection sont traités empiriquement avec des antibiotiques lors de la suspicion initiale de septicémie, en attendant les résultats de l'hémoculture conventionnelle. Actuellement, plus de 85 % des nourrissons très prématurés (âge gestationnel < 30 semaines) reçoivent des antibiotiques pour le risque de septicémie précoce aux Pays-Bas.

Il est de plus en plus évident que, outre la résistance aux antibiotiques, l'utilisation d'antibiotiques pendant la période néonatale et pendant l'enfance altère le microbiome avec un risque accru d'effets indésirables immédiats et à long terme, tels qu'un risque accru d'asthme, d'obésité, d'allergies et d'inflammations. maladies intestinales (MICI). Pour éviter un traitement inutile des nourrissons non infectés, un test de laboratoire précoce, rapide, sensible et spécifique serait utile pour guider les cliniciens dans la décision d'arrêter les antibiotiques dès que possible.

Une technique prometteuse pour détecter la septicémie néonatale rapidement et à un stade plus précoce par rapport à l'hémoculture conventionnelle est la culture moléculaire (CM). MC est une technique de culture moléculaire avancée et rapide qui est capable d'identifier les bactéries dans les 4 heures suivant le prélèvement sanguin. En bref, MC est une technique de profilage basée sur l'ADN, différenciant les espèces bactériennes en fonction des différences spécifiques à l'espèce dans la longueur des nucléotides de la région interspacer (IS) de l'ADNr 16S-23S en utilisant des amorces de réaction en chaîne par polymérase (PCR) marquées par fluorescence spécifiques au phylum. Une procédure IS-pro standard consiste en deux PCR distinctes. Dans la première PCR, deux amorces différentes sont ajoutées, une amorce marquant par fluorescence les membres des phyla Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria et Verrucomicrobia (FAFV), tandis que la seconde amorce marque les membres du phylum Bacteroidetes. Dans la deuxième PCR, une troisième amorce marquée est ajoutée ciblant les membres du phylum Proteobacteria. Par la suite, ces produits de PCR peuvent être amplifiés et les fragments d'ADN peuvent être séparés en fonction de leur longueur de nucléotide. Finalement, un profil microbien IS-pro typique sera créé, composé d'un ensemble de pics de couleur. Chaque pic représentant une unité taxonomique opérationnelle (OTU) bactérienne individuelle en fonction de la longueur des nucléotides du fragment IS-pro, la longueur de ces pics démontrant la concentration de cette OTU particulière, tandis que les couleurs des pics fournissent des informations sur les phylums actuels (FAFV, Bacteroidetes ou Protéobactéries). La figure 3 montre une représentation schématique du concept de fonctionnement de la procédure IS-pro.

Figure 3. Représentation schématique du concept de la procédure IS-pro. (A) Toutes les espèces bactériennes contiennent au moins une région IS dans leur chromosome. Cependant, de nombreuses espèces contiennent plusieurs allèles de la région IS. Ces régions peuvent varier entre différents allèles. Représenté ici est la situation schématique dans E. faecalis qui contient quatre allèles de la région IS. Deux allèles ont une longueur de 275 nt et les deux autres ont une longueur de 377 nt. Lorsqu'il est amplifié, un profil spécifique d'E. faecalis est obtenu. (B) Les profils IS sont très diversifiés entre les différentes espèces. Le fait que les espèces ont généralement plusieurs allèles de longueurs différentes augmente considérablement le potentiel différentiel entre les espèces. (C) En amplifiant les fragments IS avec des amorces marquées par fluorescence spécifiques au phylum, une couche suivante d'informations est ajoutée. (D) Lorsqu'un profil IS est composé d'un échantillon contenant plusieurs espèces de différents phylums, des pics de différentes longueurs, hauteurs et couleurs sont trouvés. Ceux-ci correspondent aux espèces, à l'abondance et au phylum. Un profil de pic peut être traduit en une liste d'espèces bactériennes par un algorithme logiciel lié à une base de données de profils IS d'espèces bactériennes connues. L'ensemble de la procédure IS-pro, de l'échantillon non traité aux données analysées, peut être effectuée en 4 h.

Dans la septicémie bactérienne, une bactérie a atteint la circulation sanguine autrement stérile provoquant la septicémie. L'hémoculture et le MC peuvent détecter des bactéries et donner un résultat positif (dans le cas où une bactérie a été cultivée) ou un résultat négatif (dans le cas où aucune bactérie n'a été détectée). Si les tests sont positifs, les deux techniques montrent également quelle bactérie a été trouvée, ce qui pourrait être utilisé pour modifier le régime antibiotique afin de cibler cette bactérie cultivée spécifique. Cependant, le processus de MC peut être terminé en 4 heures, ce qui est beaucoup plus court que la période d'incubation de l'hémoculture de référence qui est de 36 à 72 heures. Lorsqu'il n'y a pas de septicémie (et donc pas de bactéries dans la circulation sanguine), le MC se révélera également négatif dans les 4 heures et peut donc guider les cliniciens pour arrêter les antibiotiques chez les nourrissons non infectés beaucoup plus rapidement par rapport à l'hémoculture conventionnelle.

Les hémocultures sont toujours l'étalon-or, mais on suppose généralement qu'elles ont une faible sensibilité pour le diagnostic de la septicémie chez les nouveau-nés et qu'elles prennent du temps. Des cas de septicémie peuvent être manqués par des cultures et un test de diagnostic plus sensible tel que des tests moléculaires comme le MC peut être utile. Les progrès de la technologie microbienne ont conduit au développement de méthodes moléculaires rapides, qui peuvent être plus sensibles que la culture. Plusieurs nouvelles techniques moléculaires, telles que la PCR quantitative, la PCR conventionnelle à large spectre et la PCR multiplex, ont été étudiées pour détecter la septicémie néonatale. Cependant, ces techniques sont dirigées vers des espèces spécifiques ce qui rend impossible la détection de toutes les espèces bactériennes. Ainsi, tout ce qui n'est pas explicitement recherché sera manqué. En revanche, MC avait la capacité de détecter toutes les espèces bactériennes pouvant provoquer une septicémie bactérienne néonatale.

La technique MC a été validée en externe pour détecter les bactéries. Une série d'articles validant tous les aspects de la technique MC ont été publiés ces dernières années. De plus, la MC est déjà utilisée dans certains hôpitaux de l'unité de soins intensifs pour détecter des bactéries dans des échantillons autrement stériles comme le sang, mais aussi sur des échantillons provenant d'abcès. Dans une cohorte précédente, les chercheurs de ce groupe de recherche ont démontré que la MC peut être un outil utile pour diagnostiquer la septicémie chez les nouveau-nés à l'aide de sang de cordon. Cependant, il s'agissait d'une petite cohorte et aucune grande étude n'a été réalisée pour analyser la pertinence de la MC dans la détection de la septicémie bactérienne chez les nouveau-nés.

Les résultats d'autres études utilisant la technique MC pour détecter les bactéries dans les fluides corporels humains sont prometteurs. Dans l'une de ces études, 66 échantillons ont été prélevés et testés par culture conventionnelle et MC. Dans 100 % des échantillons avec une culture positive, le MC était également positif. Dans cinq échantillons, la culture conventionnelle s'est avérée négative, alors que la MC était positive. Les antécédents de ces cinq patients ont été obtenus et ont suggéré que les résultats de MC étaient très pertinents sur le plan clinique et pouvaient donc avoir une sensibilité plus élevée par rapport à l'hémoculture conventionnelle.

En résumé, la détection rapide fait de la MC une technique très prometteuse pour détecter la septicémie chez les nouveau-nés à l'aide de sang de cordon. Cependant, l'adéquation de MC dans cette population spécifique n'a pas été étudiée auparavant. Par conséquent, une grande étude de haute qualité doit être réalisée pour déterminer la précision diagnostique du MC pour la septicémie chez les nouveau-nés utilisant du sang de cordon.