分子培养诊断新生儿败血症

新生儿经常因怀疑败血症而接受抗生素治疗。 败血症在新生儿中具有高发病率和死亡率。 大约 5% 的新生儿和超过 85% 的极早产儿根据经验接受抗生素治疗。 产后，通常会为新生儿病房的假定细菌感染开抗生素，但在这些患者中，大约 90-96% 的细菌感染未得到证实。

新生儿败血症的快速诊断是有问题的，因为临床症状开始时很微妙并且是非特异性的。 诊断细菌性新生儿败血症的金标准是常规血培养。 不幸的是，细菌培养非常耗时（结果时间长达 36-72 小时）并且在该人群中缺乏敏感性。 出于这个原因，具有感染危险因素或感染临床体征和症状的新生儿在最初怀疑脓毒症时根据经验使用抗生素治疗，等待常规血培养结果。 目前，在荷兰，超过 85% 的极早产婴儿（胎龄 <30 周）接受抗生素治疗，以应对早发性败血症的风险。

越来越多的证据表明，除了抗生素耐药性外，在新生儿期和儿童期使用抗生素会改变微生物群，增加立即和长期不良反应的风险，例如增加患哮喘、肥胖、过敏和炎症的风险肠道疾病（IBD）。 为了避免对未感染婴儿进行不必要的治疗，早期、快速、敏感和特异的实验室检测将有助于指导临床医生尽快决定何时停用抗生素。

与传统血培养相比，一种有前途的快速检测新生儿败血症的技术是分子培养 (MC)。 MC 是一种先进的快速分子培养技术，能够在采血后 4 小时内识别出细菌。 简而言之，MC 是一种基于 DNA 的分析技术，通过使用门特异性荧光标记聚合酶链反应 (PCR) 引物，根据 16S-23S rDNA 间隔区 (IS) 区域核苷酸长度的物种特异性差异区分细菌物种。 标准的 IS-pro 程序由两个独立的 PCR 组成。 在第一个 PCR 中，添加了两种不同的引物，一种引物荧光标记厚壁菌门、放线菌门、梭杆菌门和疣微菌门 (FAFV) 的成员，而第二种引物标记拟杆菌门的成员。 在第二个 PCR 中，添加了第三个标记的引物，以靶向变形杆菌门的成员。 随后，可以扩增这些 PCR 产物，并可以根据核苷酸长度分离 DNA 片段。 最终，将创建一个典型的 IS-pro 微生物概况，由一组颜色标记的峰组成。 每个峰代表一个单独的细菌操作分类单元 (OTU)，具体取决于 IS-pro 片段的核苷酸长度，这些峰的长度表明该特定 OTU 的浓度，而峰颜色提供有关当前门（FAFV、拟杆菌或变形菌门）。 图 3 显示了 IS-pro 过程如何工作的概念的示意图。

图 3. IS-pro 程序背后的概念示意图。 (A) 所有细菌物种在其染色体中至少包含一个 IS 区域。 然而，许多物种包含 IS 区域的多个等位基因。 这些区域可能因等位基因不同而不同。 这里描绘的是包含 IS 区域的四个等位基因的粪肠球菌的示意图。 两个等位基因的长度为 275 nt，另外两个等位基因的长度为 377 nt。 放大后，获得粪肠球菌特有的概况。 (B) IS 配置文件在不同物种之间高度多样化。 物种通常具有多个不同长度的等位基因这一事实极大地增加了物种之间的差异潜力。 (C) 通过用门特异性荧光标记引物扩增 IS 片段，添加了下一层信息。 (D) 当 IS 配置文件由包含来自不同门的多个物种的样本组成时，会发现具有不同长度、高度和颜色的峰。 这些对应于物种、丰度和门。 通过链接到已知细菌物种 IS 概况数据库的软件算法，可以将峰概况转化为细菌物种列表。 从未处理的样品到分析数据的整个 IS-pro 过程可以在 4 小时内完成。

在细菌性败血症中，细菌已经到达原本无菌的血液中，导致败血症。 血培养和 MC 都可以检测细菌并给出阳性结果（如果培养出细菌）或阴性结果（如果未检测到细菌）。 如果测试结果呈阳性，这两种技术还会显示发现了哪些细菌，这些细菌可用于改变抗生素治疗方案以针对特定的培养细菌。 而MC的过程可在4小时内完成，远短于金标血培养36-72小时的潜伏期。 当没有败血症（因此血流中没有细菌）时，MC 也会在 4 小时内转为阴性，因此与传统血培养相比，可以指导临床医生更快地停止对未感染婴儿使用抗生素。

血培养仍然是金标准，但通常被认为对新生儿败血症的诊断敏感性低且耗时。 脓毒症病例可能会被培养遗漏，更敏感的诊断测试如分子测试可能会有用，因为 MC。 微生物技术的进步导致了快速分子方法的发展，这可能比培养更敏感。 已经研究了多种新型分子技术，例如定量 PCR、广谱常规 PCR 和多重 PCR 来检测新生儿败血症。 然而，这些技术针对特定物种，因此无法检测所有细菌物种。 因此，任何未明确搜索的内容都将丢失。 相比之下，MC 能够检测出每一种可能导致细菌性新生儿败血症的细菌种类。

MC 技术已经过外部验证，可以检测细菌。 去年发表了一系列验证 MC 技术各个方面的论文。 此外，MC 已经在一些医院的重症监护病房中用于检测无菌标本（如血液）中的细菌，以及从脓肿中获取的样本。 在之前的队列中，该研究小组的研究人员证明，MC 可能是使用脐带血诊断新生儿败血症的有用工具。 然而，这是一个小队列，没有进行大型研究来分析 MC 在检测新生儿细菌性败血症中的适用性。

使用 MC 技术检测人体体液中细菌的其他研究结果很有希望。 在其中一项研究中，通过常规培养和 MC 收集和测试了 66 个样本。 在 100% 的阳性培养样本中，MC 也呈阳性。 在五个样本中，常规培养结果为阴性，而 MC 为阳性。 获得了这五名患者的病史，表明 MC 结果与临床高度相关，因此与传统血培养相比可能具有更高的敏感性。

总之，快速检测使 MC 成为一种非常有前途的技术，可以使用脐带血检测新生儿败血症。 然而，MC 在这个特定人群中的适用性以前没有被调查过。 因此，应该进行大规模、高质量的研究，以确定 MC 对使用脐带血的新生儿败血症的诊断准确性。