Molekuláris kultúra az újszülöttkori szepszis diagnosztizálására

Az újszülöttek gyakran kapnak antibiotikumot szepszis gyanúja miatt. A szepszisnek magas a morbiditása és mortalitása az újszülötteknél. Az újszülöttek körülbelül 5%-a és a nagyon koraszülött csecsemők több mint 85%-a kap empirikusan antibiotikumot. Posztnatálisan gyakran írnak fel antibiotikumot feltételezett bakteriális fertőzésekre az újszülött osztályokon, de ezeknek a betegeknek körülbelül 90-96%-ánál nem bizonyított a bakteriális fertőzés.

A szepszis gyors diagnosztizálása újszülötteknél problematikus, mivel a klinikai tünetek finomak és nem specifikusak. A bakteriális újszülöttkori szepszis diagnosztizálásának arany standardja a hagyományos vérkultúra. Sajnos a baktériumtenyésztés időigényes (az eredmény eléréséhez szükséges idő akár 36-72 óra is lehet), és ebben a populációban nincs érzékenység. Emiatt a fertőzés kockázati tényezőivel vagy a fertőzés klinikai tüneteivel rendelkező újszülötteket kezdeti szepszis gyanú esetén empirikusan kezelik antibiotikumokkal, megvárva a hagyományos vértenyésztés eredményeit. Jelenleg a nagyon koraszülött csecsemők (30 hét alatti terhességi kor) több mint 85%-a kap antibiotikumot a korai szepszis kockázata miatt Hollandiában.

Egyre több bizonyíték áll rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy az antibiotikum-rezisztencia mellett az antibiotikumok újszülöttkori és gyermekkori alkalmazása megváltoztatja a mikrobiomot, és megnövekszik az azonnali és hosszú távú káros hatások kockázata, mint például az asztma, az elhízás, az allergia és a gyulladások fokozott kockázata. bélbetegségek (IBD). A nem fertőzött csecsemők szükségtelen kezelésének elkerülése érdekében egy korai, gyors, érzékeny és specifikus laboratóriumi vizsgálat hasznos lenne, hogy a klinikusok el tudják dönteni, mikor kell a lehető leghamarabb abbahagyni az antibiotikum-kezelést.

Ígéretes technika az újszülöttkori szepszis gyors és korábbi stádiumban történő kimutatására a hagyományos vérkultúrához képest a molekuláris kultúra (MC). Az MC egy fejlett, gyors molekuláris alapú tenyésztési technika, amely a vérmintavételt követő 4 órán belül képes azonosítani a baktériumokat. Röviden, az MC egy DNS-alapú profilalkotási technika, amely a 16S-23S rDNS interspacer (IS) régió nukleotidhosszának fajspecifikus különbségei alapján tesz különbséget a baktériumfajok között, törzsspecifikus fluoreszcensen jelölt polimeráz láncreakciós (PCR) primerek használatával. Egy szabványos IS-pro eljárás két különálló PCR-ből áll. Az első PCR-ben két különböző primert adnak hozzá, az egyik primer fluoreszcensen jelöli a phyla Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria és Verrucomicrobia (FAFV) tagjait, míg a második primer a Bacteroidetes törzs tagjait jelöli. A második PCR-ben egy harmadik jelölt primert adnak hozzá, amely a Proteobacteria törzs tagjait célozza meg. Ezt követően ezek a PCR-termékek amplifikálhatók, és a DNS-fragmensek nukleotidhosszuk alapján elválaszthatók. Végül egy tipikus IS-pro mikrobaprofil jön létre, amely színnel jelölt csúcsokból áll. Minden egyes csúcs egy egyedi bakteriális működési taxonómiai egységet (OTU) képvisel, az IS-pro fragmentum nukleotidhosszától függően, ezen csúcsok hossza az adott OTU koncentrációját mutatja, míg a csúcsok színei a jelenlévő törzsről (FAFV, Bacteroidetes ill. Proteobaktériumok). A 3. ábra az IS-pro eljárás működési koncepciójának sematikus ábrázolását mutatja.

3. ábra. Az IS-pro eljárás mögötti koncepció sematikus ábrázolása. (A) Minden baktériumfaj tartalmaz legalább egy IS régiót a kromoszómájában. Sok faj azonban több allélt tartalmaz az IS régióból. Ezek a régiók a különböző allélok között változhatnak. Itt látható az E. faecalis sematikus helyzete, amely az IS régió négy allélját tartalmazza. Két allél hossza 275 nt, a másik kettő pedig 377 nt. Ha felerősítjük, az E. faecalisra specifikus profilt kapunk. (B) Az IS profilok igen változatosak a különböző fajok között. Az a tény, hogy a fajok általában több, különböző hosszúságú allélt tartalmaznak, drámaian megnöveli a fajok közötti különbségi potenciált. (C) Az IS-fragmensek törzsspecifikus, fluoreszcensen jelölt primerekkel való amplifikálásával egy következő információréteget adunk hozzá. (D) Ha egy IS-profilt több, különböző törzsből származó fajt tartalmazó mintából készítenek, különböző hosszúságú, magasságú és színű csúcsokat találunk. Ezek megfelelnek a fajnak, a bőségnek és a törzsnek. A csúcsprofil lefordítható baktériumfajok listájára egy szoftveralgoritmus segítségével, amely az ismert baktériumfajok IS-profiljainak adatbázisához kapcsolódik. A teljes IS-pro eljárás a feldolgozatlan mintától az elemzett adatokig 4 ​​óra alatt elvégezhető.

Bakteriális szepszisben egy baktérium elérte az egyébként steril véráramot, ami szepszist okoz. Mind a vérkultúra, mind az MC képes kimutatni a baktériumokat, és pozitív eredményt ad (ha baktériumot tenyésztettek) vagy negatív eredményt (ha nem észleltek baktériumot). Abban az esetben, ha a tesztek pozitívak, mindkét technika azt is megmutatja, hogy mely baktériumokat találták, amelyekkel módosítani lehetne az antibiotikum-kezelést az adott tenyésztett baktérium megcélzására. Az MC folyamata azonban 4 órán belül befejezhető, ami jóval rövidebb, mint a gold standard vértenyészet inkubációs ideje, amely 36-72 óra. Ha nincs szepszis (és így nincsenek baktériumok a véráramban), az MC 4 órán belül is negatív lesz, és így a hagyományos vérkultúrához képest sokkal gyorsabban leállíthatja az antibiotikumokat nem fertőzött csecsemőknél.

A vérkultúrák még mindig aranystandardnak számítanak, de általában feltételezik, hogy alacsony érzékenységgel rendelkeznek az újszülöttek szepszisének diagnosztizálására, és időigényesek. A szepszis eseteit kihagyhatják a tenyészetek, és hasznos lehet egy érzékenyebb diagnosztikai teszt, például molekuláris tesztek, mint például az MC. A mikrobiális technológia fejlődése gyors molekuláris módszerek kifejlesztéséhez vezetett, amelyek érzékenyebbek lehetnek, mint a tenyésztés. Számos új molekuláris technikát, például kvantitatív PCR-t, széles körű hagyományos PCR-t és multiplex PCR-t tanulmányoztak az újszülöttkori szepszis kimutatására. Ezek a technikák azonban meghatározott fajokra irányulnak, ami lehetetlenné teszi az összes baktériumfaj kimutatását. Így minden, amit nem keresnek kifejezetten, hiányozni fog. Ezzel szemben az MC képes volt kimutatni minden olyan baktériumfajt, amely bakteriális újszülöttkori szepszist okozhat.

Az MC technikát külsőleg validálták a baktériumok kimutatására. Az elmúlt években egy sor tanulmány jelent meg, amelyek az MC technika minden aspektusát érvényesítik. Ezenkívül az MC-t már használják egyes kórházakban az intenzív osztályon, hogy kimutatják a baktériumokat egyébként steril mintákban, például vérben, de a tályogokból vett mintákon is. Egy korábbi kohorszban ennek a kutatócsoportnak a kutatói kimutatták, hogy az MC hasznos eszköz lehet az újszülöttek szepszisének köldökzsinórvér segítségével történő diagnosztizálására. Ez azonban egy kis kohorsz volt, és nem végeztek nagy vizsgálatokat annak elemzésére, hogy az MC alkalmas-e az újszülöttek bakteriális szepszisének kimutatására.

Ígéretesek az emberi testfolyadékban lévő baktériumok kimutatására szolgáló, MC technikát alkalmazó egyéb vizsgálatok eredményei. Az egyik ilyen vizsgálatban 66 mintát gyűjtöttek és teszteltek hagyományos kultúrával és MC-vel. A pozitív tenyészetet tartalmazó minták 100%-ában az MC is pozitív volt. Öt mintában a hagyományos tenyészet negatívnak bizonyult, míg az MC pozitív volt. Ennek az öt betegnek a kórtörténetét összegyűjtöttük, és azt sugallták, hogy az MC-leletek klinikailag rendkívül relevánsak voltak, és így nagyobb érzékenységgel rendelkezhetnek a hagyományos vértenyészethez képest.

Összefoglalva, a gyors kimutatás az MC-t nagyon ígéretes technikává teszi az újszülöttek szepszisének köldökzsinórvérrel történő kimutatására. Az MC alkalmasságát azonban ebben a specifikus populációban korábban nem vizsgálták. Ezért nagy, magas színvonalú vizsgálatot kell végezni az újszülöttek szepszisének MC diagnosztikai pontosságának köldökzsinórvér felhasználásával történő meghatározására.