新生児敗血症の診断のための分子培養

新生児はしばしば敗血症の疑いで抗生物質を投与されます。 敗血症は、新生児の罹患率と死亡率が高いです。 すべての新生児の約 5% と超早産児の 85% 以上が経験的に抗生物質を投与されています。 生後、新生児病棟では細菌感染が疑われる場合に抗生物質が処方されることがよくありますが、これらの患者の約 90 ～ 96% では細菌感染が証明されていません。

新生児の敗血症の迅速な診断には問題があります。これは、臨床徴候が微妙に始まり、非特異的であるためです。 細菌性新生児敗血症の診断のゴールド スタンダードは、従来の血液培養です。 残念ながら、細菌培養には時間がかかり (結果が得られるまでに最大 36 ～ 72 時間かかります)、この集団では感度が低くなります。 このため、感染の危険因子または感染の臨床徴候および症状を有する新生児は、従来の血液培養の結果を待って、最初の敗血症の疑いで経験的に抗生物質で治療されます。 現在、オランダでは超早産児 (妊娠 30 週未満) の 85% 以上が、早発性敗血症のリスクに対して抗生物質を投与されています。

抗生物質耐性とは別に、新生児期および小児期に抗生物質を使用するとマイクロバイオームが変化し、喘息、肥満、アレルギー、炎症のリスクの増加など、即時および長期の悪影響のリスクが増加するという証拠が増えています。腸疾患（IBD）。 感染していない乳児の不必要な治療を避けるために、臨床医が抗生物質をできるだけ早く中止する時期を決定するために、早期、迅速、高感度、かつ特異的な臨床検査が役立ちます。

新生児敗血症を迅速かつ従来の血液培養と比較して早期に検出する有望な手法は、分子培養 (MC) です。 MC は、採血後 4 時間以内に細菌を識別することができる、高度で迅速な分子ベースの培養技術です。 つまり、MC は DNA ベースのプロファイリング手法であり、門固有の蛍光標識ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) プライマーを使用して、16S-23S rDNA インタースペーサー (IS) 領域のヌクレオチド長の種特異的な違いに基づいて細菌種を区別します。 標準的な IS-pro 手順は、2 つの個別の PCR で構成されます。 最初の PCR では、2 つの異なるプライマーが追加されます。一方のプライマーは、ファーミキューテス門、アクチノバクター、フソバクテリア、ベルコミクロビア (FAFV) のメンバーを蛍光標識し、2 番目のプライマーはバクテロイデス門のメンバーを標識します。 2 番目の PCR では、プロテオバクテリア門のメンバーをターゲットとする 3 番目の標識プライマーが追加されます。 続いて、これらの PCR 産物を増幅し、DNA 断片をそのヌクレオチド長に基づいて分離することができます。 最終的に、典型的な IS-pro 微生物プロファイルが作成され、色でラベル付けされたピークのセットで構成されます。 IS-proフラグメントのヌクレオチド長に応じて個々の細菌の操作上の分類単位（OTU）を表す各ピーク、これらのピークの長さはこの特定のOTUの濃度を示し、ピークの色は現在の門（FAFV、Bacteroidetesまたはプロテオバクテリア）。 図 3 は、IS-pro 手順がどのように機能するかの概念の概略図を示しています。

図 3. IS-pro 手順の背後にある概念の概略図。 (A) すべての細菌種は、染色体に少なくとも 1 つの IS 領域を含んでいます。 ただし、多くの種は IS 領域の複数の対立遺伝子を含んでいます。 これらの領域は、異なる対立遺伝子間で異なる場合があります。 ここに描かれているのは、IS 領域の 4 つの対立遺伝子を含む大便連鎖球菌の概略的な状況です。 2 つの対立遺伝子の長さは 275 nt で、他の 2 つの対立遺伝子の長さは 377 nt です。 増幅すると、大便連鎖球菌に特異的なプロファイルが得られます。 (B) IS プロファイルは、異なる種の間で非常に多様です。 種が一般的に異なる長さの複数の対立遺伝子を持っているという事実は、種間の差の可能性を劇的に増加させます。 (C) 門固有の蛍光標識プライマーを使用して IS フラグメントを増幅することにより、次の層の情報が追加されます。 (D) 異なる門からの複数の種を含むサンプルで IS プロファイルを作成すると、長さ、高さ、色の異なるピークが見つかります。 これらは、種、存在量、および門に対応しています。 既知の細菌種のＩＳプロファイルのデータベースにリンクされたソフトウェアアルゴリズムによって、ピークプロファイルを細菌種のリストに変換することができる。 未処理のサンプルから分析データまでの IS-pro 手順全体を 4 時間で実行できます。

細菌性敗血症では、細菌が無菌の血流に到達し、敗血症を引き起こします。 血液培養と MC の両方で細菌を検出し、陽性結果 (細菌が培養された場合) または陰性結果 (細菌が検出されなかった場合) を得ることができます。 テストが陽性の場合、どちらの技術もどの細菌が見つかったかを示します。これは、特定の培養細菌を標的とするように抗生物質レジメンを変更するために使用できます。 ただし、MC のプロセスは 4 時間以内に完了することができます。これは、ゴールド スタンダードの血液培養の潜伏期間である 36 ～ 72 時間よりもはるかに短い時間です。 敗血症がない場合 (したがって、血流中に細菌が存在しない場合)、MC は 4 時間以内に陰性になるため、臨床医は、従来の血液培養と比較して、感染していない乳児の抗生物質をはるかに迅速に中止することができます。

血液培養は依然としてゴールド スタンダードですが、新生児の敗血症の診断には感度が低く、時間がかかると一般的に考えられています。 敗血症の症例は、培養によって見逃される可能性があり、MC として分子検査などのより感度の高い診断検査が役立つ可能性があります。 微生物技術の進歩により、培養よりも感度の高い迅速な分子的手法が開発されました。 新生児敗血症を検出するために、定量的 PCR、広範囲の従来の PCR、マルチプレックス PCR などの複数の新しい分子技術が研究されています。 ただし、これらの技術は特定の種に向けられているため、すべての細菌種を検出することは不可能です。 したがって、明示的に検索されていないものはすべて見逃されます。 対照的に、MC には細菌性新生児敗血症を引き起こす可能性のあるすべての細菌種を検出する能力がありました。

MC 技術は、細菌を検出するために外部で検証されています。 MC 手法のすべての側面を検証する一連の論文が昨年公開されました。 さらに、MC はすでに一部の病院の集中治療室で使用されており、それ以外の場合は血液などの無菌標本だけでなく、膿瘍から得られたサンプルでも細菌を検出しています。 以前のコホートで、この研究グループの研究者は、MC が臍帯血を使用して新生児の敗血症を診断するための有用なツールである可能性があることを示しました。 ただし、これは小さなコホートであり、新生児の細菌性敗血症の検出におけるMCの適合性を分析するための大規模な研究は行われていません。

人間の体液中の細菌を検出する MC 技術を使用して他の研究からの結果は有望です。 これらの研究の 1 つでは、66 のサンプルが収集され、従来の培養と MC によってテストされました。 培養が陽性のサンプルの 100% で、MC も陽性でした。 5 つのサンプルでは、​​従来の培養は陰性であることが判明しましたが、MC は陽性でした。 これら 5 人の患者の病歴が得られ、MC 所見は臨床的に非常に関連性が高く、したがって従来の血液培養と比較して感度が高い可能性があることが示唆されました。

要約すると、迅速な検出により、MC は臍帯血を使用して新生児の敗血症を検出するための非常に有望な手法になります。 ただし、この特定の集団における MC の適合性は以前に調査されていません。 したがって、臍帯血を使用して新生児の敗血症の MC の診断精度を決定するには、大規模で質の高い研究を実施する必要があります。