Molekylær kultur for diagnostisering av neonatal sepsis

Nyfødte får ofte antibiotika ved mistanke om sepsis. Sepsis har høy sykelighet og dødelighet hos nyfødte. Rundt 5 % av alle nyfødte og over 85 % av svært for tidlig fødte spedbarn får antibiotika empirisk. Postnatalt foreskrives ofte antibiotika ved antatte bakterielle infeksjoner på neonatalavdelinger, men hos ca. 90-96 % av disse pasientene er ikke bakteriell infeksjon påvist.

Rask diagnose av sepsis hos nyfødte er problematisk fordi kliniske tegn starter subtile og er uspesifikke. Gullstandarden for diagnostisering av bakteriell neonatal sepsis er en konvensjonell blodkultur. Dessverre er bakteriekultur tidkrevende (tid til resultat opp til 36-72 timer) og mangler følsomhet i denne populasjonen. Av denne grunn blir nyfødte med risikofaktorer for infeksjon eller kliniske tegn og symptomer på infeksjon behandlet med antibiotika empirisk ved innledende mistanke om sepsis, i påvente av resultater fra den konvensjonelle blodkulturen. For tiden mottar mer enn 85 % av svært premature spedbarn (svangerskapsalder <30 uker) antibiotika for risikoen for tidlig debut av sepsis i Nederland.

Det er økende bevis for at, bortsett fra antibiotikaresistens, bruk av antibiotika i nyfødtperioden og i barndommen endrer mikrobiomet med økt risiko for umiddelbare og langsiktige bivirkninger, slik som økt risiko for astma, fedme, allergier og inflammatoriske effekter. tarmsykdommer (IBD). For å unngå unødvendig behandling av ikke-infiserte spedbarn, vil en tidlig, rask, sensitiv og spesifikk laboratorietest være nyttig for å veilede klinikere til å bestemme når de skal seponere antibiotika så snart som mulig.

En lovende teknikk for å oppdage neonatal sepsis raskt og på et tidligere stadium sammenlignet med konvensjonell blodkultur er Molecular Culture (MC). MC er en avansert, rask molekylærbasert dyrkingsteknikk som er i stand til å identifisere bakterier innen 4 timer etter blodprøvetaking. Kort sagt er MC en DNA-basert profileringsteknikk, som skiller mellom bakteriearter basert på artsspesifikke forskjeller i 16S-23S rDNA interspacer (IS) region nukleotidlengde ved å bruke fylumspesifikke fluorescensmerkede polymerasekjedereaksjon (PCR) primere. En standard IS-pro-prosedyre består av to separate PCR-er. I den første PCR tilsettes to forskjellige primere, en primer som fluorescerende merker medlemmer av phyla Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria og Verrucomicrobia (FAFV), mens den andre primeren merker medlemmer av Bacteroidetes phylum. I den andre PCR tilsettes en tredje merket primer rettet mot medlemmer av phylum Proteobacteria. Deretter kan disse PCR-produktene amplifiseres og DNA-fragmenter kan separeres basert på deres nukleotidlengde. Etter hvert vil det bli opprettet en typisk IS-pro mikrobiell profil, bestående av et sett med fargemerkede topper. Hver topp representerer en individuell bakteriell operasjonell taksonomisk enhet (OTU) avhengig av nukleotidlengden til IS-pro-fragmentet, lengden på disse toppene viser konsentrasjonen av denne spesielle OTUen, mens toppfarger gir informasjon om den nåværende phyla (FAFV, Bacteroidetes eller Proteobakterier). Figur 3 viser en skjematisk fremstilling av konseptet for hvordan IS-pro-prosedyren fungerer.

Figur 3. Skjematisk fremstilling av konseptet bak IS-pro-prosedyren. (A) Alle bakteriearter inneholder minst en IS-region i kromosomet. Imidlertid inneholder mange arter flere alleler fra IS-regionen. Disse regionene kan variere mellom ulike alleler. Avbildet her er den skjematiske situasjonen i E. faecalis som inneholder fire alleler fra IS-regionen. To alleler har en lengde på 275 nt, og de to andre har en lengde på 377 nt. Ved amplifisert oppnås en profil spesifikk for E. faecalis. (B) IS-profiler er svært forskjellige mellom forskjellige arter. Det faktum at arter ofte har flere alleler med forskjellig lengde øker dramatisk differensialpotensialet mellom arter. (C) Ved å amplifisere IS-fragmenter med fylumspesifikke fluorescensmerkede primere, legges et neste lag med informasjon. (D) Når en IS-profil er laget av en prøve som inneholder flere arter fra forskjellige phyla, blir topper med forskjellig lengde, høyde og farge funnet. Disse tilsvarer arter, overflod og fylum. En toppprofil kan oversettes til en liste over bakteriearter ved hjelp av en programvarealgoritme knyttet til en database med IS-profiler av kjente bakteriearter. Hele IS-pro-prosedyren fra ubehandlet prøve til analyserte data kan utføres på 4 timer.

Ved bakteriell sepsis har en bakterie nådd den ellers sterile blodstrømmen og forårsaker sepsis. Både blodkultur og MC kan påvise bakterier og gi et positivt resultat (i tilfelle en bakterie har blitt dyrket) eller et negativt resultat (i tilfelle ingen bakterier ble påvist). I tilfelle testene er positive, viser begge teknikkene også hvilke bakterier som ble funnet, som kan brukes til å endre antibiotikakur for å målrette mot den spesifikke dyrkede bakterien. Prosessen med MC kan imidlertid fullføres innen 4 timer, som er mye kortere enn inkubasjonsperioden for gullstandard-blodkulturen som er 36-72 timer. Når det ikke er sepsis (og dermed ingen bakterier i blodet), vil MC vise seg negativ også innen 4 timer og kan dermed veilede klinikere til å stoppe antibiotika hos uinfiserte spedbarn mye raskere sammenlignet med konvensjonell blodkultur.

Blodkulturer er fortsatt gullstandard, men antas generelt å ha lav sensitivitet for diagnostisering av sepsis hos nyfødte og er tidkrevende. Tilfeller av sepsis kan bli savnet av kulturer og en mer sensitiv diagnostisk test som molekylære tester som MC kan være nyttig. Fremskritt innen mikrobiell teknologi har ført til utviklingen av raske molekylære metoder, som kan være mer følsomme enn kultur. Flere nye molekylære teknikker, som kvantitativ PCR, bredspektret konvensjonell PCR og multipleks PCR, har blitt studert for å oppdage neonatal sepsis. Imidlertid er disse teknikkene rettet mot spesifikke arter som gjør det umulig å oppdage alle bakteriearter. Dermed vil alt som ikke er eksplisitt søkt etter gå glipp av. I motsetning til dette hadde MC evnen til å oppdage alle bakteriearter som kan forårsake bakteriell neonatal sepsis.

MC-teknikken er eksternt validert for å oppdage bakterier. En serie artikler som validerer alle aspekter av MC-teknikken har blitt publisert i fjor. Videre brukes MC allerede på enkelte sykehus på intensivavdelingen for å oppdage bakterier i ellers sterile prøver som blod, men også på prøver tatt fra abscesser. I en tidligere kohort viste etterforskerne fra denne forskningsgruppen at MC kan være et nyttig verktøy for å diagnostisere sepsis hos nyfødte ved bruk av navlestrengsblod. Dette var imidlertid en liten kohort og det er ikke utført store studier for å analysere egnetheten av MC til å påvise bakteriell sepsis hos nyfødte.

Resultater fra andre studier som bruker MC-teknikken for å oppdage bakterier i menneskelig kroppsvæske er lovende. I en av disse studiene ble 66 prøver samlet og testet med konvensjonell kultur og MC. I 100 % av prøvene med positiv kultur var MC også positiv. I fem prøver viste den konvensjonelle kulturen seg å være negativ, mens MC var positiv. Kasushistoriene til disse fem pasientene ble innhentet og antydet at MC-funnene var svært klinisk relevante, og dermed kan ha høyere sensitivitet sammenlignet med konvensjonell blodkultur.

Oppsummert gjør den raske påvisningen MC til en meget lovende teknikk for å oppdage sepsis hos nyfødte ved bruk av navlestrengsblod. Egnetheten til MC i denne spesifikke populasjonen har imidlertid ikke blitt undersøkt tidligere. Derfor bør en stor studie av høy kvalitet utføres for å bestemme den diagnostiske nøyaktigheten til MC for sepsis hos nyfødte som bruker navlestrengsblod.