Bewertung der Strongyloidiasis in Ecuador: eine Feldlabor-Genauigkeitsstudie (ESTRELLA)

Ziel und Ziele Das Ziel dieses Projekts ist es, grundlegende Informationen über die Leistung und Anwendbarkeit diagnostischer Methoden zur Beurteilung einer S. stercoralis-Infektion bereitzustellen, um Informationen für das bevorstehende globale Strongyloidiasis-Kontrollprogramm der WHO zu liefern, das als Teil der WHO-Seuchenkontrolle 2030 implementiert werden soll Ziele.

Spezifische Ziele sind:

1. Abschätzung der Genauigkeit ausgewählter diagnostischer Methoden, die derzeit für die Diagnose von S. stercoralis verfügbar sind;
2. Bewertung der Akzeptanz jedes Tests und der zugehörigen Probennahmemethode durch die Zielpopulation;
3. Bewertung der Durchführbarkeit jedes Assays für den Einsatz als feldbasierte Diagnostik und als Überwachungs- und Bewertungsinstrument in endemischen Gebieten

Methoden Eine Querschnittsstudie in einem Gebiet mit hoher Prävalenz von Strongyloidiasis, basierend auf zuvor gesammelten, vorläufigen Daten. Die Studie wird einen schulbasierten Ansatz haben.

Studiengebiet und Teilnehmer Die Studie wird in Ecuador in San Lorenzo, Provinz Esmeraldas, durchgeführt. Administrativ ist San Lorenzo in 12 ländliche Gemeinden unterteilt (Alto Tambo, Ancón de Sardinas (Palma Real), Calderón, Carondelet, 5 de junio, Concepción, Mataje, San Javier de Cachaviì, Santa Rita, Tambillo, Tululbíì- Ricaurte, Urbina) , von denen zwei nur über das Meer erreichbar sind (Tambillo, eine Insel, und Ancon de Sardinas oder Palma Real, die an der Küste des Ozeans liegen).

Der Gesundheitsbezirk San Lorenzo hat seinen Sitz in der Hauptstadt, wo es ein Krankenhaus mit 75 Betten und 4 Grundfachgebieten (Medizin, Pädiatrie, Gynäko-Geburtshilfe und Chirurgie) und ein 24-Stunden-Gesundheitszentrum für ambulante Besuche, Labortests und Impfungen gibt , kleinere Operationen und Hilfe bei einer unkomplizierten Geburt. Darüber hinaus gibt es an mehreren Orten 12 Gesundheitszentren, die alle kürzlich renoviert und mit Strom versorgt wurden. In jedem Gesundheitszentrum gibt es ein Team, das sich aus einem Arzt, einer Krankenschwester, einem Zahnarzt, einer Hebamme und einer medizinischen Fachkraft der ersten Ebene zusammensetzt. Die Gesundheitsversorgung ist kostenlos, einschließlich Medikamente. Allerdings fehlt es oft an Nachschub. Seit Jahren koordiniert das Cecomet-Team (Esmeraldas Center for Community Epidemiology and Tropical Medicine) die epidemiologischen Aktivitäten der Gemeinschaft und die Ausbildung in der medizinischen Grundversorgung. Jedes Gesundheitszentrum umfasst eine unterschiedliche Anzahl von Dörfern, die alle 2/3 Monate vom Gesundheitsteam besucht werden. Letztere führt präventive Aktivitäten durch, überwacht chronische Patienten und bestimmte Risikogruppen. Einige Gesundheitspromotoren, die verschiedenen ethnischen Gruppen angehören, arbeiten seit Jahren als Freiwillige auf dem Gebiet, mit der Rolle von Gesundheitsaufsehern und Koordinatoren zwischen Teams und Gemeinschaften.

Jeden Monat nehmen Promoter und Teams an einem von Cecomet koordinierten Treffen teil, um die Aktivitäten zu überwachen, klinische Fälle zu besprechen und die Todesfälle zu melden. Die Teilnehmer sind eingeladen, mögliche Maßnahmen zur Verhinderung von Morbidität und Mortalität zu diskutieren und die Besuche in den Dörfern im nächsten Monat zu planen. Die vorherrschende Pathologie spiegelt den epidemiologischen Wandel wider, der in vielen Ländern der südlichen Hemisphäre im Gange ist: Neben der Persistenz von infektiösen/parasitären Krankheiten wie Malaria, Chagas-Krankheit, Dengue, Chikungunya, Tuberkulose und Leishmaniose hat die chronisch degenerative Pathologie, insbesondere Bluthochdruck und Diabetes, zugenommen jetzt erhebliche epidemiologische Bedeutung. Darmparasiten sind angesichts der Knappheit oder Nichtexistenz grundlegender Dienstleistungen (sauberes Wasser und sanitäre Einrichtungen) nach wie vor ein großes Problem für Kinder.

Die Studie wird in 5 der 12 ländlichen Gemeinden von San Lorenzo, in den Grundschulen von 7 Dörfern (Calderon, Carondelet, Ricaurte, S.Rita, S.Francisco del Bogotà, La Boca, Tambillo) durchgeführt, die hauptsächlich von Afro- Nachkommenschaft.

Studienverfahren In jeder Gemeinde werden Informations- und Aufklärungstreffen abgehalten, um die Bevölkerung über Strongyloidiasis, die Ziele der Studie und die Methodik der Probennahme zu informieren. In diesem Zusammenhang werden Aufklärungsbroschüren und audiovisuelle Medien verwendet, die an die lokale Bevölkerungskultur angepasst sind.

Interventionstermine werden in Absprache mit den Gemeinden, den lokalen Behörden und den Schulleitungen geplant. Vor der Durchführung der Studie wird die informierte Zustimmung der Eltern/Erziehungsberechtigten der Kinder eingeholt.

Am Tag der Studie wird jeder Teilnehmer aufgefordert, Kot- und Blutproben (von Fingerstichen) für die Testverfahren abzugeben, und wird (als PC) mit einer Einzeldosis von 200 mcg/kg Ivermectin und einer Einzeldosis von 400 mg Albendazol behandelt den internationalen Standards und lokalen Protokollen entsprechen. Ein Fallberichtsformular (CRF) wird verwendet, um Informationen zu relevanten Symptomen und anderen relevanten Merkmalen in Bezug auf das Hygieneniveau zu sammeln. Jedes CRF wird mit einem anonymisierten ID-Code gekennzeichnet, der das CRF mit den von jedem Teilnehmer gelieferten Proben verknüpft.

Kotproben werden mit der Formol-Ether-Technik von Ritchie (für STH), der Baermann-Methode (spezifisch für S. stercoralis) und mit einer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für S. stercoralis getestet. Für den letzteren Test wird ein Teil des Stuhls für den Transport zum Labor der Zentraluniversität von Quito in Ethanol konserviert. Blutproben werden durch Fingerstich entnommen und auf Filterpapier zur anschließenden Analyse mit zwei ELISA-Assays (einer auf der Basis von Rohantigen und einer auf einem rekombinanten Antigen) und einem Schnelltest (RDT) entnommen.

Alle Tests werden in demselben Land durchgeführt, in dem die Proben entnommen werden, in Übereinstimmung mit den Anforderungen eines Tests, der in Kontrollprogrammen verwendet werden soll.

Diagnosetest

• Kottests Die Baermann-Methode wird gemäß den Verfahren durchgeführt, die in den „Bench aids for the diagnostic of intestinal parasitosis“ der WHO beschrieben sind.

Die PCR ist ein Echtzeit-Assay, der auf der Methode von Verweji basiert. Kurz gesagt werden für die DNA-Extraktion etwa 200 mg Fäkalien in 200 &mgr;l phosphatgepufferter Kochsalzlösung suspendiert, die 2 % Polyvinylpolypyrrolidon (Sigma-Aldrich) enthält, und über Nacht bei –20 °C bis zur Extraktion eingefroren. Nach dem Auftauen und Kochen werden die Proben durch ein automatisiertes Extraktionsgerät (Magnapure LC.2, Roche) geleitet. Der Echtzeit-Assay wird wie zuvor beschrieben durchgeführt. Das Amplifikationsziel ist die rRNA-Gensequenz mit kleinen Untereinheiten für S. stercoralis. Geeignete Positiv- und Negativkontrollen sind in allen Experimenten enthalten. Als Kontrolle für PCR-Inhibitoren und Amplifikationsqualität wird die PhHV-1-Kontroll-DNA mit dem entsprechenden Primer/Sonden-Mix in der gleichen Reaktion wie S. stercoralis in der Multiplex-PCR amplifiziert. Die Reaktionen, der Nachweis und die Datenanalyse werden mit dem CFX96-Nachweissystem (Bio-Rad Laboratories) durchgeführt. In einer früheren retrospektiven Studie zeigte die Methode eine Sensitivität von 56,8 % (95 % KI 41,0–71,6)[10].

Serologische Tests

• Der InBios Strongy Detect TM IgG ELISA weist spezifische IgG-Antikörper gegen die rekombinanten Strongyloides-Antigene NIE und SsIR im Serum nach. Ein früheres Kit enthielt nur NIE-Antigen, und die Zugabe von SsIR zielt darauf ab, die Leistung des Tests zu verbessern, der aus einem enzymatisch amplifizierten Immunoassay vom Sandwich-Typ besteht. Positive und negative Kontrollproben sind im Kit enthalten. Der Test wird gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt und interpretiert.
• Der Bordier ELISA weist Strongyloides-IgG-Antikörper durch die Verwendung von somatischen Antigenen aus Larven von Strongyloides ratti nach. Eine frühere retrospektive Studie schätzte seine Sensitivität und Spezifität auf 90,8 % (95 % KI 85,8-95,7) und 94,0 % (95 % KI 91,2-96,9)[12], bzw. Der Test wird gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Da der Cutoff jedoch zwischen den Läufen variiert, verwenden wir ein normalisiertes Verhältnis der optischen Dichte (OD), um die in verschiedenen Sitzungen erzielten Ergebnisse zu vergleichen. Ein Verhältnis ≥1 definiert positive Ergebnisse. Der Test ist weit verbreitet und wird für routinemäßige Screening- und diagnostische Aktivitäten in ganz Europa eingesetzt.
• Der RDT ist ein Dipstick-Schnelltest, der vom Institute for Research in Molecular Medicine (INFORMM) der University Sais Malaysia, Malaysia, durchgeführt wird. Eine frühere Studie berichtete über eine Sensitivität und Spezifität von 91,3 % bzw. 100 %. Das Testergebnis ist qualitativ und basiert auf dem Erscheinen/Fehlen einer farbigen Testbande 15 Minuten nach Zugabe der Probe in die vorgesehene Vertiefung. Das Vorhandensein von zwei roten Linien im Testergebnis (Test- und Kontrolllinie) wird als positiv gewertet, wohingegen ein Teststreifen, der nur eine rote Linie (Kontrolllinie) zeigt, als negativ gewertet wird.

Stichprobengröße

Für die Berechnung des Stichprobenumfangs wurden Sensitivität und Spezifität der zu bewertenden diagnostischen Tests wie folgt berücksichtigt:

TEST Sensitivität Spezifität Baerman 0,5 0,98 ELISA Bordier 0,9 0,93

ELISA NIE 0,7 0,91

PCR 0,6 0,95

RDT 0,9 1,0

Die Stichprobengröße von 640 Personen wurde für 95 % Konfidenz, 10 % Präzision und eine geschätzte Prävalenz von 15 % berechnet.

Endpunkte und vorgesehene Analyse:

Demographische und klinische Daten werden unter Verwendung deskriptiver Statistiken, Variabilitäts- und Präzisionsmaße und Plots zusammengefasst. Statistische Tests werden basierend auf der Art der Variablen, den Testannahmen und der Stichprobengröße verwendet. Alle Parameter werden mit 95 % Konfidenzintervallen angegeben.

1. A) Die Sensitivität und Spezifität der serologischen Assays und des Schnelltests werden zunächst mit den Ergebnissen von Baermann und PCR verglichen, die beide als praktisch 100 % spezifisch für den Studienzweck angesehen werden. Daher wird die Genauigkeit jedes Tests als Anteil positiver Ergebnisse an allen positiven (für die Sensitivität) und negativen (für die Spezifität) Proben nach Baermann und/oder PCR berechnet. Die Unsicherheit wird durch 95 %-Konfidenzintervalle quantifiziert.

   B) In Anbetracht dessen, dass Baerman und PCR möglicherweise eine geringere Sensitivität aufweisen als die anderen Tests, was zu einer Fehleinschätzung der (zu niedrigen) Spezifität der anderen Tests, der Sensitivität, Spezifität, des negativen Vorhersagewerts (NPV) und des positiven Vorhersagewerts (PPV) führen kann. aller Tests werden auch gegen einen zusammengesetzten Referenzstandard berechnet[16]. Dies basiert auf einer Kombination der Ergebnisse aller Tests, insbesondere: Fälle von Strongyloidiasis werden als Teilnehmer mit positiver PCR UND/ODER Baermann UND/ODER einem positiven serologischen Test plus dem RDT ODER zwei positiven serologischen Tests identifiziert. Darüber hinaus werden in der latenten Klassenanalyse (LCA) probabilistische Modelle angepasst, um Probanden als erkrankt oder nicht erkrankt zu klassifizieren

2. Die Akzeptanz der Aktivität wird bewertet als a) die Anzahl der Personen, die der Teilnahme aus der gesamten Zielpopulation, der die Teilnahme an der Studie angeboten wird, zustimmen; b) die tatsächliche Bereitstellung der erforderlichen Kot-/Blutproben durch jeden einwilligenden Teilnehmer.
3. Die Durchführbarkeit jeder Technik wird bewertet a) Berechnen der Anzahl von Proben, für die ein Ergebnis jeder Technik aus allen gesammelten geeigneten Proben verfügbar sein wird; wenn kein Ergebnis verfügbar ist, wird der Grund (z. B. Probleme beim Materialtransfer/ Konservierungsmittel/ andere technische Gründe) erhoben. b) Untersuchung möglicher Probleme mit einem Fragebogen, der dem Laborpersonal ausgehändigt wird