Hodnocení strongyloidózy v Ekvádoru: terénní laboratorní studie přesnosti (ESTRELLA)

Cíl a cíle Cílem tohoto projektu je poskytnout základní informace o výkonnosti a použitelnosti diagnostických metod pro hodnocení infekce S. stercoralis a informovat o nadcházejícím globálním programu WHO pro kontrolu strongyloidózy, který bude implementován jako součást kontroly onemocnění WHO 2030 cíle.

Konkrétní cíle jsou:

1. Odhadnout přesnost vybraných aktuálně dostupných diagnostických metod pro diagnostiku S. stercoralis;
2. Vyhodnotit přijatelnost každého testu a související metody odběru vzorků cílovou populací;
3. Posoudit proveditelnost každého testu pro nasazení jako terénní diagnostiku a jako nástroj pro monitorování a hodnocení v endemických oblastech

Metody Průřezová studie v oblasti s vysokou prevalencí strongyloidózy, založená na dříve shromážděných předběžných datech. Studium bude mít školní přístup.

Studijní oblast a účastníci Studie bude provedena v Ekvádoru, v San Lorenzo, provincie Esmeraldas. Administrativně je San Lorenzo rozděleno do 12 venkovských farností (Alto Tambo, Ancón de Sardinas (Palma Real), Calderón, Carondelet, 5 de junio, Concepción, Mataje, San Javier de Cachavíì, Santa Rita, Tambillo, Tululbíì- Ricaurte, Urbina) , z nichž dva jsou přístupné pouze po moři (Tambillo, což je ostrov, a Ancon de Sardinas nebo Palma Real ležící na břehu oceánu).

San Lorenzo zdravotní obvod má sídlo v hlavním městě, kde je nemocnice se 75 lůžky a 4 základními specializacemi (lékařství, pediatrie, gynekologie a chirurgie) a 24hodinové zdravotní středisko pro ambulantní návštěvy, laboratorní testy, očkování. , drobný chirurgický zákrok a pomoc při nekomplikovaném porodu. Kromě toho je v několika lokalitách 12 zdravotních středisek, všechna nedávno zrekonstruovaná a vybavená elektřinou. V každém zdravotním středisku je tým složený z lékaře lékaře, sestry, zubního lékaře, porodní asistentky a zdravotnického pracovníka I. stupně. Zdravotní péče je bezplatná, včetně léků. Zásoby však často chybí. Komunitní epidemiologické aktivity a školení základní zdravotní péče již léta koordinuje tým Cecomet (Esmeraldas Center for Community Epidemiology and Tropical Medicine). Každé zdravotní středisko pokrývá různý počet vesnic, které každé 2/3 měsíce navštíví zdravotní tým. Ta provádí preventivní činnost, sleduje chronické pacienty a specifické rizikové skupiny. Někteří propagátoři zdraví, kteří patří k různým etnickým skupinám, pracují na území již léta jako dobrovolníci s rolí komunitních zdravotních supervizorů a koordinátorů mezi týmy a komunitami.

Každý měsíc se promotéři a týmy účastní setkání koordinovaného Cecometem s cílem monitorovat aktivity, diskutovat o klinických případech a hlásit úmrtí. Účastníci jsou vyzváni, aby prodiskutovali možná opatření k prevenci nemocnosti a úmrtnosti a naplánovali si návštěvy vesnic na příští měsíc. Převládající patologie odráží epidemiologický přechod probíhající v mnoha zemích jižní polokoule: vedle přetrvávání infekčních/parazitárních onemocnění, jako je malárie, Chagasova choroba, horečka dengue, chikungunya, tuberkulóza a leishmanióza, se projevuje chronická degenerativní patologie, zejména hypertenze a diabetes. nyní značný epidemiologický význam. Střevní parazité jsou vzhledem k nedostatku nebo neexistenci základních služeb (bezpečná voda a hygiena) i nadále velkým problémem pro děti.

Studie bude probíhat v 5 z 12 venkovských farností San Lorenzo, v základních školách 7 vesnic (Calderon, Carondelet, Ricaurte, S.Rita, S.Francisco del Bogotà, La Boca, Tambillo) obývaných převážně Afro- potomci.

Postupy studie V každé komunitě se budou konat informativní a vzdělávací setkání s cílem informovat populaci o strongyloidóze, cílech studie a metodice odběru vzorků. V tomto ohledu budou využívány osvětové letáky a audiovizuální média přizpůsobená místní kultuře obyvatelstva.

Termíny intervence budou naplánovány po dohodě s komunitami, místními úřady a řediteli škol. Před realizací studie bude požadován informovaný souhlas rodičů/zákonných zástupců dětí.

V den studie bude každý účastník vyzván, aby dodal vzorky stolice a krve (z píchnutí do prstu) pro testovací procedury, a bude léčen (jako PC) ivermektinem 200 mcg/kg jednorázovou dávkou a albendazolem 400 mg jednorázovou dávkou podle podle mezinárodních standardů a místních protokolů. Ke sběru informací o příslušných příznacích a dalších relevantních charakteristikách týkajících se úrovní sanitace bude použit formulář pro hlášení případu (CRF). Každý CRF bude označen anonymizovaným ID kódem, který propojí CRF se vzorky dodanými každým účastníkem.

Vzorky stolice budou testovány Ritchieho technikou formol-ether (pro STH), Baermannovou metodou (specifickou pro S. stercoralis) a pomocí polymerázové řetězové reakce v reálném čase (PCR) pro S. stercoralis. Pro druhý test bude část stolice uchována v etanolu pro přepravu do laboratoře Central University of Quito. Vzorky krve budou odebrány píchnutím do prstu a budou odebírány na filtrační papíry pro následnou analýzu dvěma testy ELISA (jeden založený na surovém antigenu a jeden na rekombinantním antigenu) a rychlým dipstick testem (RDT).

Všechny testy budou provedeny ve stejné zemi, kde jsou vzorky odebírány, v souladu s tím, co vyžaduje test pro použití v kontrolních programech.

Diagnostické testy

• Fekální testy Baermannova metoda bude prováděna v souladu s postupy popsanými v „Pomůcky pro diagnostiku střevních parazitóz“ WHO.

PCR je test v reálném čase založený na Verwejiho metodě. Stručně, pro extrakci DNA se asi 200 mg stolice suspenduje ve 200 ul fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku obsahujícího 2 % polyvinylpolypyrolidon (Sigma-Aldrich) a zmrazí se přes noc při -20 °C až do extrakce. Po rozmrazení a varu jsou vzorky analyzovány pomocí automatického extrakčního přístroje (Magnapure LC.2, Roche). Test v reálném čase se provádí tak, jak bylo popsáno dříve. Cílem amplifikace je sekvence genu malé podjednotky rRNA pro S. stercoralis. Ve všech experimentech jsou zahrnuty vhodné pozitivní a negativní kontroly. Jako kontrola pro inhibitory PCR a kvalitu amplifikace je kontrolní DNA PhHV-1 amplifikována pomocí vhodné směsi primerů/sond ve stejné reakci jako S. stercoralis v multiplexní PCR. Reakce, detekce a analýza dat jsou prováděny detekčním systémem CFX96 (Bio-Rad Laboratories). V předchozí retrospektivní studii metoda prokázala senzitivitu 56,8 % (95 % CI 41,0–71,6)[10].

Sérologické testy

• InBios Strongy Detect TM IgG ELISA detekuje specifické IgG protilátky proti rekombinantním antigenům Strongyloides NIE a SsIR v séru. Předchozí souprava obsahovala pouze NIE antigen a přidání SsIR má za cíl zlepšit výkonnost testu, který sestává z enzymaticky amplifikovaného sendvičového imunotestu. Pozitivní a negativní kontrolní vzorky jsou součástí soupravy. Test bude probíhat a interpretován podle pokynů výrobce.
• Bordier ELISA detekuje Strongyloides IgG protilátky pomocí somatických antigenů z larev Strongyloides ratti. Předchozí retrospektivní studie odhadla jeho senzitivitu a specificitu na 90,8 % (95 % CI 85,8-95,7) a 94,0 % (95 % CI 91,2-96,9)[12], respektive. Test se provádí podle pokynů výrobce. Protože se však hranice mezi sériemi liší, používáme k porovnání výsledků získaných v různých relacích poměr normalizované optické hustoty (OD). Poměr ≥1 definuje pozitivní výsledky. Test je široce dostupný a nasazený pro rutinní screeningové a diagnostické činnosti v celé Evropě.
• RDT je ​​rychlý test měrkou zavedený Institutem pro výzkum molekulární medicíny (INFORMM) z University Sains Malajsie, Malajsie. Předchozí studie uváděla senzitivitu 91,3 % a specificitu 100 %. Výsledek testu je kvalitativní na základě výskytu/nepřítomnosti barevného testovacího proužku 15 minut po přidání vzorku do určené jamky. Přítomnost výsledků testu dvou červených čar (testovací a kontrolní čáry) je interpretována jako pozitivní, zatímco měrka, která ukazuje pouze jednu červenou čáru (kontrolní čára), je interpretována jako negativní.

Velikost vzorku

Pro výpočet velikosti vzorku byly citlivost a specifičnost diagnostických testů, které mají být hodnoceny, vzaty v úvahu následovně:

TEST Citlivost Specificita Baerman 0,5 0,98 ELISA Bordier 0,9 0,93

ELISA NIE 0,7 0,91

PCR 0,6 0,95

RDT 0,9 1,0

Velikost vzorku 640 jedinců byla vypočtena pro 95% spolehlivost, 10% přesnost a odhadovanou prevalenci 15%.

Koncové body a předpokládaná analýza:

Demografické a klinické údaje budou shrnuty pomocí deskriptivní statistiky, míry variability a přesnosti a grafů. Budou použity statistické testy založené na typu proměnných, testovacích předpokladech a rozměru vzorku. Všechny parametry budou hlášeny s 95% intervalem spolehlivosti.

1. A) Senzitivita a specifičnost sérologických testů a rychlého testu bude nejprve vypočítána oproti výsledkům Baermann a PCR, které jsou pro účely studie považovány za prakticky 100% specifické. Přesnost každého testu se tedy vypočítá jako podíl pozitivních výsledků na všech pozitivních (pro citlivost) a negativních (pro specificitu) vzorků na Baermann a/nebo PCR. Nejistota bude kvantifikována pomocí 95% intervalu spolehlivosti.

   B) Vzhledem k tomu, že Baerman a PCR mohou mít nižší senzitivitu než ostatní testy, což může vést k nesprávnému vyhodnocení (příliš nízké) specifičnosti ostatních testů, citlivost, specificita, negativní prediktivní hodnota (NPV) a pozitivní prediktivní hodnota (PPV) všech testů bude počítáno také podle složeného referenčního standardu[16]. To bude založeno na kombinaci výsledků všech testů, konkrétně: případy strongyloidózy budou identifikovány jako účastníci s pozitivní PCR A/NEBO Baermann A/NEBO pozitivní sérologický test plus RDT NEBO dva pozitivní sérologické testy. Kromě toho budou v analýze latentních tříd (LCA) použity pravděpodobnostní modely, aby bylo možné klasifikovat subjekty jako nemocné nebo neonemocněné.

2. Přijatelnost aktivity bude hodnocena jako a) počet lidí, kteří souhlasí s účastí, z celé cílové populace, které bude účast ve studii nabídnuta; b) skutečné poskytnutí požadovaných vzorků stolice/krve každým souhlasným účastníkem.
3. Bude vyhodnocena proveditelnost každé techniky a) výpočet počtu vzorků, pro které bude k dispozici výsledek každé techniky ze všech vhodných odebraných vzorků; není-li k dispozici výsledek, bude shromážděn důvod (například problémy s přenosem materiálu/konzervační látky/jiné technické důvody) b) prošetření možných problémů pomocí dotazníku zadaného personálu laboratoře