Avaliação da estrongiloidíase no Equador: um estudo de precisão laboratorial de campo (ESTRELLA)

Meta e objetivos O objetivo deste projeto é fornecer informações fundamentais sobre o desempenho e aplicabilidade de métodos de diagnóstico para a avaliação da infecção por S. stercoralis para informar o próximo programa global de controle da estrongiloidíase da OMS a ser implementado como parte do controle de doenças da OMS 2030 alvos.

Os objetivos específicos são:

1. Estimar a precisão de métodos diagnósticos selecionados atualmente disponíveis para o diagnóstico de S. stercoralis;
2. Avaliar a aceitabilidade de cada teste e método de coleta de amostra relacionado pela população-alvo;
3. Avaliar a viabilidade de cada ensaio para implantação como diagnóstico de campo e como ferramenta de monitoramento e avaliação em áreas endêmicas

Métodos Estudo transversal em área de alta prevalência de estrongiloidíase, baseado em dados preliminares previamente coletados. O estudo terá uma abordagem baseada na escola.

Área de estudo e participantes O estudo será realizado no Equador, em San Lorenzo, província de Esmeraldas. Administrativamente, San Lorenzo está dividido em 12 freguesias rurais (Alto Tambo, Ancón de Sardinas (Palma Real), Calderón, Carondelet, 5 de junio, Concepción, Mataje, San Javier de Cachavíì, Santa Rita, Tambillo, Tululbíì- Ricaurte, Urbina) , duas das quais só podem ser alcançadas por mar (Tambillo que é uma ilha, e Ancon de Sardinas ou Palma Real localizada nas margens do oceano).

O distrito sanitário de San Lorenzo tem sua sede na capital, onde funciona um hospital com 75 leitos e 4 especialidades básicas (medicina, pediatria, gineco-obstetrícia e cirurgia) e um centro de saúde 24 horas para consultas externas, exames laboratoriais, vacinações , pequena cirurgia e assistência com parto sem complicações. Além disso, existem 12 centros de saúde em várias localidades, todos recentemente renovados e equipados com eletricidade. Em cada centro de saúde existe uma equipa composta por um médico, um enfermeiro, um dentista, uma parteira e um profissional de saúde de primeiro nível. Os cuidados de saúde são gratuitos, incluindo medicamentos. No entanto, muitas vezes faltam suprimentos. As atividades de epidemiologia comunitária e formação em saúde básica são coordenadas há anos pela equipe do Cecomet (Centro de Epidemiologia Comunitária e Medicina Tropical de Esmeraldas). Cada centro de saúde cobre um número variável de aldeias, que recebem uma visita da equipe de saúde a cada 2/3 meses. Este último realiza atividades preventivas, monitora pacientes crônicos e grupos específicos de risco. Alguns promotores de saúde, pertencentes a diferentes etnias, atuam há anos no território como voluntários, com o papel de supervisores comunitários de saúde e coordenadores entre equipes e comunidades.

Todos os meses, promotores e equipes participam de uma reunião coordenada pelo Cecomet com o objetivo de acompanhar as atividades, discutir casos clínicos e notificar os óbitos. Os participantes são convidados a discutir possíveis medidas para prevenir morbidade e mortalidade e planejar as visitas às aldeias no próximo mês. A patologia predominante reflete a transição epidemiológica em curso em muitos países do hemisfério sul: ao lado da persistência de doenças infecciosas/parasitárias como malária, doença de Chagas, dengue, chikungunya, tuberculose e leishmaniose, a patologia crônico-degenerativa, especialmente hipertensão e diabetes, tem agora considerável importância epidemiológica. As parasitas intestinais, dada a escassez ou inexistência de serviços básicos (água potável e saneamento) continuam a ser um grande problema para as crianças.

O estudo será realizado em 5 das 12 paróquias rurais de San Lorenzo, nas escolas primárias de 7 aldeias (Calderon, Carondelet, Ricaurte, S.Rita, S.Francisco del Bogotá, La Boca, Tambillo) habitadas principalmente por afro- descendentes.

Procedimentos do estudo Serão realizadas reuniões informativas e educativas em cada comunidade para informar a população sobre a estrongiloidíase, os objetivos do estudo e a metodologia de coleta das amostras. Para isso, serão utilizados folhetos educativos e meios audiovisuais adaptados à cultura da população local.

As datas de intervenção serão planeadas em acordo com as comunidades, as autoridades locais e os gestores escolares. O consentimento informado dos pais/responsáveis ​​das crianças será solicitado antes da implementação do estudo.

No dia do estudo, cada participante será convidado a fornecer amostras de fezes e sangue (por picada no dedo) para os procedimentos de teste e será tratado (como PC) com ivermectina 200 mcg/Kg dose única e albendazol 400 mg dose única de acordo aos padrões internacionais e protocolos locais. Um Formulário de Relato de Caso (CRF) será usado para coletar informações sobre sintomas relevantes e outras características relevantes relativas aos níveis de saneamento. Cada CRF será marcado com um código de identificação anônimo, que vinculará o CRF às amostras fornecidas por cada participante.

Amostras fecais serão testadas com a técnica de formol-éter de Ritchie (para STH), método de Baermann (específico para S. stercoralis) e com reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real para S. stercoralis. Para este último teste, parte das fezes será preservada em etanol para transporte ao Laboratório da Universidade Central de Quito. Amostras de sangue serão obtidas por picada no dedo, e serão coletadas em papel filtro para posterior análise com dois ensaios ELISA (um baseado no antígeno bruto e outro no antígeno recombinante) e um teste rápido com fita reagente (RDT).

Todos os testes serão realizados no mesmo país onde as amostras são coletadas, de acordo com o exigido por um teste a ser usado em programas de controle.

Testes de diagnóstico

• Os testes fecais pelo método de Baermann serão realizados de acordo com os procedimentos descritos no "Banco de auxílio para o diagnóstico de parasitoses intestinais", da OMS.

A PCR é um ensaio em tempo real baseado no método de Verweji. Resumidamente, para extração de DNA, cerca de 200 mg de fezes são suspensos em 200 µL de solução salina tamponada com fosfato contendo 2% de polivinilpolipirrolidona (Sigma-Aldrich) e congelados durante a noite a -20 °C até a extração. Após descongelamento e fervura, as amostras são processadas por um instrumento extrator automatizado (Magnapure LC.2, Roche). O ensaio em tempo real é realizado conforme descrito anteriormente. O alvo da amplificação é a sequência do gene rRNA de subunidade pequena para S. stercoralis. Controles positivos e negativos apropriados são incluídos em todos os experimentos. Como controle para inibidores de PCR e qualidade de amplificação, o DNA de controle de PhHV-1 é amplificado com a mistura de primers/sonda apropriada na mesma reação que S. stercoralis em PCR multiplex. As reações, detecção e análise de dados são realizadas com o sistema de detecção CFX96 (Bio-Rad Laboratories). Em um estudo retrospectivo anterior, o método demonstrou uma sensibilidade de 56,8% (IC 95% 41,0-71,6)[10].

Testes sorológicos

• O InBios Strongy Detect TM IgG ELISA detecta anticorpos IgG específicos para os antígenos recombinantes Strongyloides NIE e SsIR no soro. Um kit anterior incluía apenas o antígeno NIE, e a adição de SsIR visa melhorar o desempenho do teste, que consiste em um imunoensaio do tipo sanduíche amplificado enzimaticamente. Amostras de controle positivo e negativo são fornecidas no kit. O teste será executado e interpretado de acordo com as instruções do fabricante.
• O Bordier ELISA detecta anticorpos Strongyloides IgG usando antígenos somáticos de larvas de Strongyloides ratti. Um estudo retrospectivo anterior estimou sua sensibilidade e especificidade em 90,8% (IC 95% 85,8-95,7) e 94,0% (IC95% 91,2-96,9)[12], respectivamente. O teste é realizado de acordo com as instruções do fabricante. No entanto, como o corte varia entre as execuções, usamos uma relação de densidade óptica (OD) normalizada para comparar os resultados obtidos em diferentes sessões. Uma proporção ≥1 define resultados positivos. O teste está amplamente disponível e implantado para triagem de rotina e atividades de diagnóstico em toda a Europa.
• O RDT é um teste rápido de vareta implementado pelo Institute for Research in Molecular Medicine (INFORMM) da University Sains Malaysia, Malásia. Um estudo anterior relatou sensibilidade e especificidade de 91,3% e 100%, respectivamente. O resultado do teste é qualitativo, baseado no aparecimento/ausência de uma faixa de teste colorida 15 minutos após a adição da amostra no poço designado. A presença de O resultado do teste duas linhas vermelhas (linhas de teste e controle) é interpretada como positiva, enquanto a vareta que mostra apenas uma linha vermelha (linha de controle) é interpretada como negativa.

Tamanho da amostra

Para o cálculo do tamanho da amostra, a sensibilidade e a especificidade dos testes diagnósticos a serem avaliados foram consideradas da seguinte forma:

TESTE Sensibilidade Especificidade Baerman 0,5 0,98 ELISA Bordier 0,9 0,93

ELISA NIE 0,7 0,91

PCR 0,6 0,95

RDT 0,9 1,0

O tamanho da amostra de 640 indivíduos foi calculado para 95% de confiança, 10% de precisão e uma prevalência estimada de 15%.

Pontos finais e análise prevista:

Os dados demográficos e clínicos serão resumidos usando estatísticas descritivas, medidas de variabilidade e precisão e gráficos. Serão utilizados testes estatísticos com base no tipo de variáveis, pressupostos dos testes e dimensão da amostra. Todos os parâmetros serão relatados com intervalos de confiança de 95%.

1. A) A sensibilidade e especificidade dos testes sorológicos e do teste rápido serão primeiramente calculadas contra os resultados de Baermann e PCR, ambos considerados praticamente 100% específicos para o objetivo do estudo. Portanto, a precisão de cada teste será calculada como a proporção de resultados positivos sobre todas as amostras positivas (para sensibilidade) e negativas (para especificidade) para Baermann e/ou PCR. A incerteza será quantificada por intervalos de confiança de 95%.

   B) Considerando que Baerman e PCR podem ter sensibilidades mais baixas do que os outros testes, o que pode resultar em erro de avaliação da especificidade (muito baixa) dos outros testes, a sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo (VPN) e valor preditivo positivo (VPP) de todos os testes serão calculados também contra um padrão de referência composto[16]. Isso será baseado em uma combinação dos resultados de todos os testes, especificamente: os casos de estrongiloidíase serão identificados como participantes com PCR positivo E/OU Baermann E/OU teste sorológico positivo mais o RDT OU dois testes sorológicos positivos. Além disso, na análise de classes latentes (LCA) serão ajustados modelos probabilísticos para classificar os sujeitos como doentes ou não doentes

2. A aceitabilidade da atividade será avaliada como a) o número de pessoas que consentem em participar de toda a população-alvo à qual será oferecida a participação no estudo; b) o fornecimento efetivo das amostras fecais/sangue necessárias por cada participante que consente.
3. A viabilidade de cada técnica será avaliada a) calculando o número de amostras para as quais um resultado de cada técnica estará disponível de todas as amostras adequadas coletadas; quando um resultado não estiver disponível, o motivo (por exemplo, problemas com transferência de material/conservante/outras razões técnicas) será coletado b) investigação de possíveis problemas com um questionário aplicado ao pessoal do laboratório