Valutazione della Strongiloidiasi in Ecuador: uno studio sull'accuratezza del laboratorio sul campo (ESTRELLA)

Scopo e obiettivi Lo scopo di questo progetto è fornire informazioni fondamentali sulle prestazioni e l'applicabilità dei metodi diagnostici per la valutazione dell'infezione da S. stercoralis per informare il prossimo programma globale di controllo della strongiloidiasi dell'OMS da implementare come parte del controllo della malattia dell'OMS 2030 bersagli.

Obiettivi specifici sono:

1. Stimare l'accuratezza dei metodi diagnostici selezionati attualmente disponibili per la diagnosi di S. stercoralis;
2. Valutare l'accettabilità di ciascun test e relativo metodo di raccolta del campione da parte della popolazione target;
3. Valutare la fattibilità di ciascun test per la distribuzione come diagnostica sul campo e come strumento di monitoraggio e valutazione nelle aree endemiche

Metodi Uno studio trasversale in un'area ad alta prevalenza di strongiloidiasi, basato su dati preliminari raccolti in precedenza. Lo studio avrà un approccio basato sulla scuola.

Area di studio e partecipanti Lo studio sarà condotto in Ecuador, a San Lorenzo, provincia di Esmeraldas. Amministrativamente, San Lorenzo è divisa in 12 parrocchie rurali (Alto Tambo, Ancón de Sardinas (Palma Real), Calderón, Carondelet, 5 de junio, Concepción, Mataje, San Javier de Cachavíì, Santa Rita, Tambillo, Tululbíì- Ricaurte, Urbina) , due delle quali raggiungibili solo via mare (Tambillo che è un'isola, e Ancon de Sardinas o Palma Real situata sulle rive dell'oceano).

Il distretto sanitario di San Lorenzo ha sede nel capoluogo dove sono presenti un ospedale con 75 posti letto e 4 specialità di base (medicina, pediatria, gineco-ostetricia e chirurgia), e un presidio sanitario aperto 24 ore su 24 per visite ambulatoriali, esami di laboratorio, vaccinazioni , piccola chirurgia e assistenza al parto senza complicazioni. Inoltre, sono presenti 12 presidi sanitari in diverse località, tutti recentemente ristrutturati e dotati di energia elettrica. In ogni presidio è presente un'équipe composta da un medico, un infermiere, un dentista, un'ostetrica e un operatore sanitario di primo livello. L'assistenza sanitaria è gratuita, compresi i medicinali. Tuttavia, le forniture sono spesso carenti. Le attività di epidemiologia comunitaria e formazione sanitaria di base sono coordinate da anni dal team del Cecomet (Centro Esmeraldas di epidemiologia comunitaria e medicina tropicale). Ogni centro sanitario copre un numero variabile di villaggi, che ricevono una visita ogni 2/3 mesi dal team sanitario. Quest'ultimo svolge attività di prevenzione, monitora i pazienti cronici e specifici gruppi a rischio. Alcuni promotori di salute, appartenenti a diverse etnie, operano sul territorio da anni come volontari, con il ruolo di supervisori sanitari di comunità e coordinatori tra equipe e comunità.

Ogni mese promotori e team partecipano a un incontro coordinato dal Cecomet con l'obiettivo di monitorare le attività, discutere casi clinici e denunciare i decessi. I partecipanti sono invitati a discutere le possibili misure per prevenire la morbilità e la mortalità e pianificare le visite ai villaggi del mese successivo. La patologia prevalente riflette la transizione epidemiologica in atto in molti Paesi del sud del mondo: accanto al persistere di malattie infettive/parassitarie quali malaria, morbo di Chagas, dengue, chikungunya, tubercolosi e leishmaniosi, si è affiancata la patologia cronico degenerativa, soprattutto ipertensione e diabete ormai notevole importanza epidemiologica. I parassiti intestinali, data la scarsità o l'inesistenza di servizi di base (acqua potabile e servizi igienici) continuano a rappresentare un problema importante per i bambini.

Lo studio si svolgerà in 5 delle 12 parrocchie rurali di San Lorenzo, nelle scuole primarie di 7 villaggi (Calderon, Carondelet, Ricaurte, S.Rita, S.Francisco del Bogotà, La Boca, Tambillo) abitati prevalentemente da afro- discendenti.

Modalità dello studio In ogni comunità si terranno incontri informativi ed educativi per informare la popolazione sulla strongiloidiasi, gli obiettivi dello studio e la metodologia per la raccolta dei campioni. A questo proposito verranno utilizzati opuscoli educativi e supporti audiovisivi adattati alla cultura della popolazione locale.

Le date degli interventi saranno pianificate in accordo con le comunità, le autorità locali ei dirigenti scolastici. Il consenso informato dei genitori/tutori dei bambini sarà richiesto prima dell'implementazione dello studio.

Il giorno dello studio, ogni partecipante sarà invitato a fornire campioni di feci e sangue (da puntura del dito) per le procedure di test e sarà trattato (come PC) con ivermectina 200 mcg/Kg in dose singola e albendazolo 400 mg in dose singola secondo agli standard internazionali e ai protocolli locali. Verrà utilizzato un Case Report Form (CRF) per raccogliere informazioni sui sintomi rilevanti e altre caratteristiche rilevanti riguardanti i livelli di igiene. Ogni CRF sarà contrassegnato da un codice identificativo anonimizzato, che collegherà la CRF ai campioni forniti da ciascun partecipante.

I campioni fecali saranno testati con la tecnica formol-etere di Ritchie (per STH), il metodo Baermann (specifico per S. stercoralis) e con una reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR) per S. stercoralis. Per quest'ultimo test, una parte delle feci sarà conservata in etanolo per il trasporto al Laboratorio dell'Università Centrale di Quito. I campioni di sangue saranno prelevati mediante puntura del dito e raccolti su carta da filtro per la successiva analisi con due saggi ELISA (uno basato sull'antigene grezzo e uno su un antigene ricombinante) e un test rapido dipstick (RDT).

Tutti i test saranno eseguiti nello stesso paese in cui vengono raccolti i campioni, in conformità a quanto richiesto da un test da utilizzare nei programmi di controllo.

Test diagnostici

• I test fecali Metodo Baermann saranno eseguiti secondo le procedure descritte nei "Ausili da banco per la diagnosi delle parassitosi intestinali", a cura dell'OMS.

La PCR è un'analisi in tempo reale basata sul metodo di Verweji. In breve, per l'estrazione del DNA, circa 200 mg di feci vengono sospesi in 200 µL di soluzione salina tamponata con fosfato contenente il 2% di polivinilpolipirolidone (Sigma-Aldrich) e congelati per una notte a -20 °C fino all'estrazione. Dopo lo scongelamento e l'ebollizione, i campioni vengono analizzati da uno strumento di estrazione automatico (Magnapure LC.2, Roche). L'analisi in tempo reale viene eseguita come descritto in precedenza. Il bersaglio dell'amplificazione è la sequenza del gene rRNA a subunità piccola per S. stercoralis. Controlli positivi e negativi appropriati sono inclusi in tutti gli esperimenti. Come controllo per gli inibitori della PCR e la qualità dell'amplificazione, il DNA di controllo PhHV-1 viene amplificato con la miscela di primer/sonda appropriata nella stessa reazione di S. stercoralis nella PCR multiplex. Le reazioni, il rilevamento e l'analisi dei dati vengono eseguiti con il sistema di rilevamento CFX96 (Bio-Rad Laboratories). In un precedente studio retrospettivo il metodo ha dimostrato una sensibilità del 56,8% (IC 95% 41,0-71,6)[10].

Test sierologici

• InBios Strongy Detect TM IgG ELISA rileva gli anticorpi IgG specifici contro gli antigeni ricombinanti Strongyloides NIE e SsIR nel siero. Un kit precedente includeva solo l'antigene NIE e l'aggiunta di SsIR mira a migliorare le prestazioni del test, che consiste in un immunodosaggio di tipo sandwich amplificato enzimaticamente. I campioni di controllo positivi e negativi sono forniti nel kit. Il test verrà eseguito e interpretato secondo le istruzioni del produttore.
• Bordier ELISA rileva gli anticorpi IgG Strongyloides utilizzando antigeni somatici da larve di Strongyloides ratti. Un precedente studio retrospettivo ha stimato la sua sensibilità e specificità al 90,8% (IC 95% 85,8-95,7) e 94,0% (IC 95% 91,2-96,9)[12], rispettivamente. Il test viene eseguito secondo le istruzioni del produttore. Tuttavia, poiché il cut-off varia tra le corse, utilizziamo un rapporto di densità ottica (OD) normalizzato per confrontare i risultati ottenuti in diverse sessioni. Un rapporto ≥1 definisce risultati positivi. Il test è ampiamente disponibile e utilizzato per screening di routine e attività diagnostiche in tutta Europa.
• L'RDT è un test rapido con dipstick implementato dall'Institute for Research in Molecular Medicine (INFORMM) dell'Università Sains Malaysia, Malesia. Uno studio precedente riportava una sensibilità e una specificità rispettivamente del 91,3% e del 100%. Il risultato del test è qualitativo, basato sulla comparsa/assenza di una banda di test colorata 15 minuti dopo l'aggiunta del campione nell'apposito pozzetto. La presenza del risultato del test di due linee rosse (test e controllo) viene interpretata come positiva, mentre il dipstick che mostra una sola linea rossa (linea di controllo) viene interpretato come negativo.

Misura di prova

Per il calcolo della dimensione del campione, la sensibilità e la specificità dei test diagnostici da valutare sono state considerate come segue:

TEST Sensibilità Specificità Baerman 0,5 0,98 ELISA Bordier 0,9 0,93

ELISA NIE 0,7 0,91

PCR 0,6 0,95

RST 0,9 1,0

La dimensione del campione di 640 individui è stata calcolata per il 95% di confidenza, il 10% di precisione e una prevalenza stimata del 15%.

Endpoint e analisi prevista:

I dati demografici e clinici saranno riassunti utilizzando statistiche descrittive, misure di variabilità e precisione e grafici. Verranno utilizzati test statistici in base al tipo di variabili, alle ipotesi dei test e alla dimensione del campione. Tutti i parametri saranno riportati con intervalli di confidenza del 95%.

1. A) La sensibilità e la specificità dei saggi sierologici e del test rapido saranno dapprima calcolate rispetto ai risultati di Baermann e PCR, entrambi considerati virtualmente specifici al 100% per lo scopo dello studio. Pertanto, l'accuratezza di ciascun test sarà calcolata come la proporzione di risultati positivi su tutti i campioni positivi (per sensibilità) e negativi (per specificità) a Baermann e/o PCR. L'incertezza sarà quantificata mediante intervalli di confidenza al 95%.

   B) Considerando che Baerman e la PCR possono avere sensibilità inferiori rispetto agli altri test, il che può comportare una valutazione errata della specificità (troppo bassa) degli altri test, della sensibilità, della specificità, del valore predittivo negativo (VAN) e del valore predittivo positivo (PPV) di tutti i test sarà calcolato anche rispetto a uno standard di riferimento composito[16]. Questo si baserà su una combinazione dei risultati di tutti i test, in particolare: i casi di strongiloidiasi saranno identificati come partecipanti con PCR positivo E/O Baermann E/O un test sierologico positivo più RDT O due test sierologici positivi. Inoltre, nell'analisi di classe latente (LCA) verranno inseriti modelli probabilistici per classificare i soggetti come malati o non malati

2. L'accettabilità dell'attività sarà valutata come a) il numero di persone che acconsentono a partecipare rispetto all'intera popolazione target a cui sarà offerta la partecipazione allo studio; b) l'effettiva fornitura dei prescritti campioni fecali/sanguigni da parte di ciascun partecipante consenziente.
3. Verrà valutata la fattibilità di ciascuna tecnica a) calcolando il numero di campioni per i quali sarà disponibile un risultato di ciascuna tecnica tra tutti i campioni idonei raccolti; quando un risultato non è disponibile, verrà raccolto il motivo (ad esempio problemi con il trasferimento di materiale/conservante/altri motivi tecnici) b) indagare su possibili problemi con un questionario somministrato al personale di laboratorio