Evaluación de la estrongiloidiasis en el Ecuador: un estudio de precisión de laboratorio de campo (ESTRELLA)

Propósito y objetivos El propósito de este proyecto es proporcionar información fundamental sobre el rendimiento y la aplicabilidad de los métodos de diagnóstico para la evaluación de la infección por S. stercoralis para informar el próximo programa mundial de control de estrongiloidiasis de la OMS que se implementará como parte del programa de control de enfermedades de la OMS 2030 objetivos

Los objetivos específicos son:

1. Estimar la precisión de los métodos de diagnóstico seleccionados actualmente disponibles para el diagnóstico de S. stercoralis;
2. Evaluar la aceptabilidad de cada prueba y el método de recolección de muestras relacionado por parte de la población objetivo;
3. Evaluar la viabilidad de cada ensayo para el despliegue como diagnóstico de campo y como herramienta de seguimiento y evaluación en áreas endémicas.

Métodos Estudio transversal en un área de alta prevalencia de estrongiloidiasis, basado en datos preliminares previamente recolectados. El estudio tendrá un enfoque basado en la escuela.

Área de estudio y participantes El estudio se realizará en Ecuador, en San Lorenzo, provincia de Esmeraldas. Administrativamente, San Lorenzo se divide en 12 parroquias rurales (Alto Tambo, Ancón de Sardinas (Palma Real), Calderón, Carondelet, 5 de junio, Concepción, Mataje, San Javier de Cachavíì, Santa Rita, Tambillo, Tululbíì- Ricaurte, Urbina) , a dos de las cuales sólo se puede llegar por mar (Tambillo que es una isla, y Ancón de Sardinas o Palma Real situada a orillas del océano).

El distrito de salud de San Lorenzo tiene su sede en la ciudad capital donde hay un hospital con 75 camas y 4 especialidades básicas (medicina, pediatría, ginecoobstetricia y cirugía), y un centro de salud 24 horas para consultas externas, exámenes de laboratorio, vacunas , cirugía menor y asistencia con parto sin complicaciones. Además, hay 12 centros de salud en varias localidades, todos recientemente renovados y equipados con energía eléctrica. En cada centro de salud existe un equipo integrado por un médico, una enfermera, un odontólogo, una partera y un trabajador de salud de primer nivel. La atención médica es gratuita, incluidos los medicamentos. Sin embargo, a menudo faltan suministros. Las actividades de epidemiología comunitaria y capacitación básica en salud han sido coordinadas durante años por el equipo de Cecomet (Centro de Epidemiología Comunitaria y Medicina Tropical de Esmeraldas). Cada centro de salud cubre un número variable de aldeas, que reciben una visita cada 2/3 meses del equipo de salud. Este último realiza actividades preventivas, seguimiento de pacientes crónicos y grupos específicos de riesgo. Algunos promotores de salud, pertenecientes a diferentes etnias, trabajan en el territorio desde hace años como voluntarios, con el rol de supervisores comunitarios de salud y coordinadores entre equipos y comunidades.

Cada mes, promotores y equipos participan en una reunión coordinada por Cecomet con el objetivo de monitorear las actividades, discutir casos clínicos y reportar las muertes. Se invita a los participantes a discutir las posibles medidas para prevenir la morbilidad y la mortalidad, y planificar las visitas a las aldeas del próximo mes. La patología predominante refleja la transición epidemiológica en curso en muchos países del hemisferio sur: junto a la persistencia de enfermedades infecciosas/parasitarias como malaria, enfermedad de Chagas, dengue, chikungunya, tuberculosis y leishmaniasis, la patología crónico degenerativa, especialmente la hipertensión arterial y la diabetes, ha ahora considerable importancia epidemiológica. La parasitosis intestinal, dada la escasez o inexistencia de servicios básicos (agua potable y saneamiento) sigue siendo un problema importante para los niños.

El estudio se llevará a cabo en 5 de las 12 parroquias rurales de San Lorenzo, en las escuelas primarias de 7 pueblos (Calderon, Carondelet, Ricaurte, S.Rita, S.Francisco del Bogotà, La Boca, Tambillo) habitados mayoritariamente por afro- descendientes.

Procedimientos del estudio Se realizarán reuniones informativas y educativas en cada comunidad para informar a la población sobre la estrongiloidiasis, los objetivos del estudio y la metodología de toma de muestras. En este sentido, se utilizarán folletos educativos y medios audiovisuales adaptados a la cultura de la población local.

Las fechas de intervención se planificarán de acuerdo con las comunidades, las autoridades locales y los directores de las escuelas. Se solicitará el consentimiento informado de los padres/tutores de los niños antes de la implementación del estudio.

El día del estudio, se invitará a cada participante a suministrar muestras de heces y sangre (de un pinchazo en el dedo) para los procedimientos de prueba, y será tratado (como CP) con ivermectina 200 mcg/Kg en dosis única y albendazol en dosis única de 400 mg según a las normas internacionales y protocolos locales. Se utilizará un Formulario de informe de caso (CRF) para recopilar información sobre síntomas relevantes y otras características relevantes relacionadas con los niveles de saneamiento. Cada CRF se marcará con un código de identificación anónimo, que vinculará el CRF con las muestras proporcionadas por cada participante.

Las muestras fecales se analizarán con la técnica de formol-éter de Ritchie (para STH), el método de Baermann (específico para S. stercoralis) y con una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real para S. stercoralis. Para esta última prueba, parte de la materia fecal se conservará en etanol para su transporte al Laboratorio de la Universidad Central de Quito. Las muestras de sangre se obtendrán mediante punción digital y se recogerán en papeles de filtro para su posterior análisis con dos ensayos ELISA (uno basado en antígeno crudo y otro en antígeno recombinante) y una prueba rápida con tira reactiva (RDT).

Todas las pruebas se realizarán en el mismo país donde se toman las muestras, de conformidad con lo que exige una prueba para ser utilizada en programas de control.

Pruebas de diagnóstico

• Las pruebas fecales método de Baermann se realizarán de acuerdo con los procedimientos descritos en los “Ayudas de banco para el diagnóstico de parasitosis intestinales”, de la OMS.

La PCR es un ensayo en tiempo real basado en el método de Verweji. Brevemente, para la extracción de ADN, se suspenden alrededor de 200 mg de heces en 200 μl de solución salina tamponada con fosfato que contiene polivinilpolipirrolidona al 2 % (Sigma-Aldrich) y se congelan durante la noche a -20 °C hasta la extracción. Después de descongelar y hervir, las muestras se analizan con un instrumento extractor automático (Magnapure LC.2, Roche). El ensayo en tiempo real se realiza como se describió anteriormente. El objetivo de amplificación es la secuencia del gen de ARNr de subunidades pequeñas para S. stercoralis. En todos los experimentos se incluyen controles positivos y negativos apropiados. Como control para los inhibidores de la PCR y la calidad de la amplificación, el ADN de control de PhHV-1 se amplifica con la mezcla adecuada de cebadores/sonda en la misma reacción que S. stercoralis en la PCR multiplex. Las reacciones, detección y análisis de datos se realizan con el sistema de detección CFX96 (Bio-Rad Laboratories). En un estudio retrospectivo anterior, el método demostró una sensibilidad del 56,8 % (95 % IC 41,0-71,6)[10].

Pruebas serológicas

• El InBios Strongy Detect TM IgG ELISA detecta anticuerpos IgG específicos contra los antígenos recombinantes de Strongyloides NIE y SsIR en suero. Un kit anterior incluía solo el antígeno NIE, y la adición de SsIR tiene como objetivo mejorar el rendimiento de la prueba, que consiste en un inmunoensayo tipo sándwich amplificado enzimáticamente. Las muestras de control positivo y negativo se proporcionan en el kit. La prueba se ejecutará e interpretará de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
• Bordier ELISA detecta anticuerpos IgG de Strongyloides mediante el uso de antígenos somáticos de larvas de Strongyloides ratti. Un estudio retrospectivo previo estimó su sensibilidad y especificidad en un 90,8% (IC 95% 85,8-95,7) y 94,0 % (95 % IC 91,2-96,9)[12], respectivamente. La prueba se realiza según las instrucciones del fabricante. Sin embargo, como el límite varía entre las ejecuciones, utilizamos una relación de densidad óptica (DO) normalizada para comparar los resultados obtenidos en diferentes sesiones. Una relación ≥1 define resultados positivos. La prueba está ampliamente disponible y se implementa para actividades de detección y diagnóstico de rutina en toda Europa.
• La RDT es una prueba rápida con tira reactiva implementada por el Instituto de Investigación en Medicina Molecular (INFORMM) de la Universidad Sains Malaysia, Malasia. Un estudio previo reportó sensibilidad y especificidad de 91.3% y 100%, respectivamente. El resultado de la prueba es cualitativo, basado en la aparición/ausencia de una banda de prueba coloreada 15 minutos después de la adición de la muestra en el pocillo designado. La presencia de dos líneas de color rojo (líneas de prueba y control) en el resultado de la prueba se interpreta como positiva, mientras que la tira reactiva que muestra solo una línea roja (línea de control) se interpreta como negativa.

Tamaño de la muestra

Para el cálculo del tamaño de la muestra, se consideró la sensibilidad y especificidad de las pruebas diagnósticas a evaluar de la siguiente manera:

PRUEBA Sensibilidad Especificidad Baerman 0,5 0,98 ELISA Bordier 0,9 0,93

ELISA NIE 0,7 0,91

RCP 0,6 0,95

PDR 0,9 1,0

El tamaño de la muestra de 640 individuos se calculó con una confianza del 95 %, una precisión del 10 % y una prevalencia estimada del 15 %.

Puntos Finales y Análisis Previsto:

Los datos demográficos y clínicos se resumirán utilizando estadísticas descriptivas, medidas de variabilidad y precisión y gráficos. Se utilizarán pruebas estadísticas en base al tipo de variables, supuestos de las pruebas y dimensión de la muestra. Todos los parámetros se reportarán con intervalos de confianza del 95%.

1. A) La sensibilidad y especificidad de los ensayos serológicos y de la prueba rápida se calcularán primero contra los resultados de Baermann y PCR, ambos considerados prácticamente 100% específicos para el propósito del estudio. Por lo tanto, la precisión de cada prueba se calculará como la proporción de resultados positivos sobre todas las muestras positivas (para sensibilidad) y negativas (para especificidad) a Baermann y/o PCR. La incertidumbre se cuantificará mediante intervalos de confianza del 95%.

   B) Teniendo en cuenta que Baerman y PCR pueden tener sensibilidades más bajas que las otras pruebas, lo que puede resultar en una evaluación errónea de la especificidad (demasiado baja) de las otras pruebas, la sensibilidad, la especificidad, el valor predictivo negativo (VPN) y el valor predictivo positivo (VPP) de todas las pruebas se calculará también frente a un patrón de referencia compuesto[16]. Esto se basará en una combinación de los resultados de todas las pruebas, específicamente: los casos de estrongiloidiasis se identificarán como participantes con PCR positiva Y/O Baermann Y/O una prueba serológica positiva más la PDR O dos pruebas serológicas positivas. Además, en el análisis de clases latentes (LCA) se ajustarán modelos probabilísticos para clasificar a los sujetos como enfermos o no enfermos.

2. La aceptabilidad de la actividad se evaluará como a) el número de personas que consientan en participar de la población objetivo total a la que se ofrecerá la participación en el estudio; b) el suministro real de las muestras de heces/sangre requeridas por parte de cada participante que dio su consentimiento.
3. Se evaluará la viabilidad de cada técnica a) calculando el número de muestras para las que se dispondrá de un resultado de cada técnica a partir de todas las muestras adecuadas recogidas; cuando un resultado no esté disponible, se recopilará el motivo (por ejemplo, problemas con la transferencia de material/conservación/otras razones técnicas) b) investigar posibles problemas con un cuestionario administrado al personal del laboratorio