Ocena węgorczycy w Ekwadorze: badanie dokładności laboratorium polowego (ESTRELLA)

Cel i cele Celem tego projektu jest dostarczenie podstawowych informacji na temat wydajności i przydatności metod diagnostycznych do oceny zakażenia S. stercoralis w celu uwzględnienia przyszłego globalnego programu zwalczania węgornicy WHO, który zostanie wdrożony jako część zwalczania choroby WHO 2030 cele.

Cele szczegółowe to:

1. Ocena trafności wybranych obecnie dostępnych metod diagnostycznych w diagnostyce S. stercoralis;
2. Aby ocenić akceptowalność każdego testu i powiązanej metody pobierania próbek przez populację docelową;
3. Aby ocenić wykonalność każdego testu do wdrożenia jako diagnostyki terenowej oraz jako narzędzia monitorowania i oceny na obszarach endemicznych

Metody Przekrojowe badanie na obszarze o dużym rozpowszechnieniu węgornicy na podstawie wcześniej zebranych, wstępnych danych. Badanie będzie miało podejście szkolne.

Obszar badań i uczestnicy Badanie zostanie przeprowadzone w Ekwadorze, w San Lorenzo, w prowincji Esmeraldas. Administracyjnie San Lorenzo jest podzielone na 12 parafii wiejskich (Alto Tambo, Ancón de Sardinas (Palma Real), Calderón, Carondelet, 5 de junio, Concepción, Mataje, San Javier de Cachaviì, Santa Rita, Tambillo, Tululbíì- Ricaurte, Urbina) , z których do dwóch można dotrzeć tylko drogą morską (Tambillo, która jest wyspą, oraz Ancon de Sardinas lub Palma Real, położona nad brzegiem oceanu).

Okręg San Lorenzo ma swoją siedzibę w stolicy, gdzie znajduje się szpital na 75 łóżek i 4 podstawowe specjalności (lekarska, pediatria, ginekologiczno-położnicza i chirurgia) oraz całodobowy ośrodek zdrowia dla wizyt ambulatoryjnych, badań laboratoryjnych, szczepień , drobne operacje i pomoc przy nieskomplikowanym porodzie. Ponadto w kilku miejscowościach znajduje się 12 ośrodków zdrowia, wszystkie niedawno odnowione i wyposażone w elektryczność. W każdym ośrodku zdrowia pracuje zespół złożony z lekarza, pielęgniarki, lekarza dentysty, położnej oraz pracownika służby zdrowia pierwszego stopnia. Opieka zdrowotna jest bezpłatna, w tym leki. Jednak często brakuje zapasów. Społecznościowe działania epidemiologiczne i szkolenia z zakresu podstawowej opieki zdrowotnej koordynowane są od lat przez zespół Cecomet (Esmeraldas Centre for Community Epidemiology and Tropical Medicine). Każdy ośrodek zdrowia obejmuje różną liczbę wiosek, które co 2/3 miesiące odwiedza zespół ds. zdrowia. Ten ostatni prowadzi działania profilaktyczne, monitoruje pacjentów przewlekle i określone grupy ryzyka. Niektórzy promotorzy zdrowia, należący do różnych grup etnicznych, od lat pracują na tym terytorium jako wolontariusze, pełniąc rolę lokalnych nadzorców zdrowia i koordynatorów między zespołami i społecznościami.

Co miesiąc promotorzy i zespoły biorą udział w spotkaniu koordynowanym przez Cecomet, którego celem jest monitorowanie działań, omawianie przypadków klinicznych i zgłaszanie zgonów. Uczestnicy są proszeni o przedyskutowanie możliwych środków zapobiegających zachorowalności i śmiertelności oraz zaplanowanie wizyt w wioskach na następny miesiąc. Dominująca patologia odzwierciedla zmiany epidemiologiczne zachodzące w wielu krajach półkuli południowej: obok utrzymywania się chorób zakaźnych/pasożytniczych, takich jak malaria, choroba Chagasa, denga, chikungunya, gruźlica i leiszmanioza, przewlekła patologia zwyrodnieniowa, zwłaszcza nadciśnienie i cukrzyca, obecnie duże znaczenie epidemiologiczne. Pasożyty jelitowe, biorąc pod uwagę niedobór lub brak podstawowych usług (bezpieczna woda i urządzenia sanitarne), nadal stanowią poważny problem dla dzieci.

Badanie odbędzie się w 5 z 12 wiejskich parafii San Lorenzo, w szkołach podstawowych w 7 wioskach (Calderon, Carondelet, Ricaurte, S.Rita, S.Francisco del Bogotà, La Boca, Tambillo) zamieszkałych głównie przez Afro- potomków.

Procedury badawcze W każdej gminie odbędą się spotkania informacyjno-edukacyjne w celu poinformowania populacji o węgornicy, celach badań oraz metodyce pobierania próbek. Wykorzystane zostaną w tym zakresie ulotki edukacyjne oraz media audiowizualne dostosowane do kultury lokalnej ludności.

Daty interwencji zostaną zaplanowane w porozumieniu ze społecznościami, władzami lokalnymi i dyrektorami szkół. Świadoma zgoda rodziców/opiekunów dzieci będzie wymagana przed rozpoczęciem badania.

W dniu badania każdy uczestnik zostanie poproszony o dostarczenie próbek kału i krwi (pobranej z palca) do procedur badawczych i zostanie potraktowany (jako PC) iwermektyną w dawce pojedynczej 200 mcg/kg i albendazolem w dawce pojedynczej 400 mg zgodnie z z międzynarodowymi standardami i lokalnymi protokołami. Formularz opisu przypadku (CRF) zostanie wykorzystany do zebrania informacji na temat istotnych objawów i innych istotnych cech dotyczących poziomów sanitarnych. Każdy CRF zostanie oznaczony zanonimizowanym kodem identyfikacyjnym, który powiąże CRF z próbkami dostarczonymi przez każdego uczestnika.

Próbki kału zostaną przebadane techniką formolowo-eterową Ritchiego (dla STH), metodą Baermanna (specyficzną dla S. stercoralis) oraz metodą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym dla S. stercoralis. W przypadku tego ostatniego testu część kału zostanie zakonserwowana w etanolu w celu transportu do Laboratorium Centralnego Uniwersytetu w Quito. Próbki krwi zostaną pobrane przez nakłucie palca i zostaną zebrane na bibule filtracyjnej do późniejszej analizy za pomocą dwóch testów ELISA (jeden oparty na surowym antygenie i jeden na rekombinowanym antygenie) oraz szybki test paskowy (RDT).

Wszystkie testy będą przeprowadzane w tym samym kraju, w którym pobierane są próbki, zgodnie z wymaganiami testu, który ma być stosowany w programach kontroli.

Testy diagnostyczne

• Badania kału metodą Baermanna będą wykonywane zgodnie z procedurami opisanymi w „Pomocach laboratoryjnych do diagnostyki pasożytów jelitowych” WHO.

PCR to test w czasie rzeczywistym oparty na metodzie Verwejiego. Pokrótce, w celu ekstrakcji DNA, około 200 mg kału zawiesza się w 200 µl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, zawierającej 2% poliwinylopolipirolidonu (Sigma-Aldrich) i zamraża przez noc w -20°C aż do ekstrakcji. Po rozmrożeniu i gotowaniu próbki analizuje się za pomocą automatycznego ekstraktora (Magnapure LC.2, Roche). Test w czasie rzeczywistym przeprowadza się jak opisano wcześniej. Celem amplifikacji jest sekwencja genu rRNA o małej podjednostce dla S. stercoralis. We wszystkich doświadczeniach uwzględniono odpowiednie kontrole pozytywne i negatywne. Jako kontrolę dla inhibitorów PCR i jakości amplifikacji, kontrolne DNA PhHV-1 amplifikuje się z odpowiednią mieszanką starterów/sond w tej samej reakcji co S. stercoralis w multipleksowym PCR. Reakcje, detekcję i analizę danych przeprowadza się za pomocą systemu detekcji CFX96 (Bio-Rad Laboratories). W poprzednim badaniu retrospektywnym czułość metody wyniosła 56,8% (95% CI 41,0-71,6)[10].

Testy serologiczne

• InBios Strongy Detect TM IgG ELISA wykrywa swoiste przeciwciała IgG przeciwko rekombinowanym antygenom Strongyloides NIE i SsIR w surowicy. Poprzedni zestaw zawierał tylko antygen NIE, a dodanie SsIR ma na celu poprawę wydajności testu, który składa się z enzymatycznie amplifikowanego testu immunologicznego typu kanapkowego. W zestawie znajdują się próbki kontroli pozytywnej i negatywnej. Test zostanie przeprowadzony i zinterpretowany zgodnie z instrukcją producenta.
• Bordier ELISA wykrywa przeciwciała Strongyloides IgG przy użyciu antygenów somatycznych z larw Strongyloides ratti. W poprzednim badaniu retrospektywnym oszacowano jego czułość i swoistość na 90,8% (95% CI 85,8-95,7) i 94,0% (95%CI 91,2-96,9)[12], odpowiednio. Test przeprowadza się zgodnie z instrukcjami producenta. Ponieważ jednak wartość odcięcia różni się w zależności od serii, do porównania wyników uzyskanych w różnych sesjach używamy znormalizowanego współczynnika gęstości optycznej (OD). Współczynnik ≥1 określa wyniki pozytywne. Test jest szeroko dostępny i stosowany w rutynowych badaniach przesiewowych i diagnostycznych w całej Europie.
• RDT to szybki test paskowy wdrożony przez Instytut Badań nad Medycyną Molekularną (INFORMM) Uniwersytetu Sains Malaysia w Malezji. W poprzednim badaniu czułość i swoistość wyniosły odpowiednio 91,3% i 100%. Wynik testu jest jakościowy, oparty na pojawieniu się/nieobecności kolorowego paska testowego 15 minut po dodaniu próbki do wyznaczonego dołka. Obecność w wyniku testu dwóch czerwonych kresek (linia testowa i kontrolna) jest interpretowana jako dodatnia, natomiast wskaźnik poziomu, który pokazuje tylko jedną czerwoną linię (linia kontrolna) jest interpretowany jako ujemny.

Wielkość próbki

Przy obliczaniu wielkości próby czułość i specyficzność ocenianych testów diagnostycznych zostały uwzględnione w następujący sposób:

TEST Czułość Swoistość Baerman 0,5 0,98 ELISA Bordier 0,9 0,93

ELISA NIE 0,7 0,91

PCR 0,6 0,95

RDT 0,9 1,0

Wielkość próby 640 osób została obliczona dla 95% pewności, 10% precyzji i szacowanej częstości występowania 15%.

Punkty końcowe i przewidywana analiza:

Dane demograficzne i kliniczne zostaną podsumowane za pomocą statystyk opisowych, miar zmienności i precyzji oraz wykresów. Stosowane będą testy statystyczne w oparciu o rodzaj zmiennych, założenia testów i wymiar próby. Wszystkie parametry zostaną podane z 95% przedziałami ufności.

1. A) Czułość i specyficzność testów serologicznych i szybkiego testu zostaną najpierw obliczone na podstawie wyników Baermanna i PCR, które uważa się za praktycznie w 100% specyficzne dla celu badania. W związku z tym dokładność każdego testu zostanie obliczona jako proporcja wyników dodatnich do wszystkich próbek dodatnich (dla czułości) i negatywnych (dla specyficzności) metodą Baermanna i/lub PCR. Niepewność zostanie określona ilościowo za pomocą 95% przedziałów ufności.

   B) Biorąc pod uwagę, że Baerman i PCR mogą mieć niższą czułość niż inne testy, co może skutkować błędną oceną (zbyt niskiej) swoistości innych testów, czułość, swoistość, ujemna wartość predykcyjna (NPV) i dodatnia wartość predykcyjna (PPV) wszystkich testów zostanie obliczona również względem złożonego wzorca odniesienia[16]. Będzie to oparte na połączeniu wyników wszystkich testów, w szczególności: przypadki węgorczycy zostaną zidentyfikowane jako uczestnicy z pozytywnym wynikiem PCR ORAZ/LUB Baermanna ORAZ/LUB pozytywnym testem serologicznym plus RDT LUB dwoma pozytywnymi testami serologicznymi. Ponadto w analizie klas ukrytych (LCA) zostaną dopasowane modele probabilistyczne w celu sklasyfikowania osobników jako chorych lub nie chorych

2. Akceptowalność działania będzie oceniana jako: a) liczba osób, które wyrażą zgodę na udział w całej populacji docelowej, której zostanie zaoferowany udział w badaniu; b) faktyczne dostarczenie wymaganych próbek kału/krwi przez każdego wyrażającego zgodę uczestnika.
3. Wykonalność każdej techniki zostanie oceniona a) obliczenie liczby próbek, dla których wynik każdej techniki będzie dostępny ze wszystkich odpowiednich zebranych próbek; gdy wynik nie jest dostępny, zostanie zebrana przyczyna (np. problemy z przenoszeniem materiału/środkiem konserwującym/inne przyczyny techniczne) b) zbadanie ewentualnych problemów za pomocą kwestionariusza rozdanego personelowi laboratorium