Ácido poliinosínico-policitidílico-poli-L-lisina carboximetilcelulosa (poli-ICLC) en voluntarios sanos

Este protocolo adoptará un enfoque de biología de sistemas para comprender en humanos una nueva área importante de biología de vacunas: el mecanismo por el cual los adyuvantes, que actúan sobre receptores de reconocimiento de patrones definidos [PRR], mejoran la inmunidad de las células T y B. Nuestro enfoque está en el ARN sintético de doble cadena, o poli IC y su forma más resistente a la RNasa, llamada poli ICLC, que está disponible para estudios en humanos. Los PRR son la helicasa citosólica, MDA-5, y el receptor tipo toll endosomal, TLR3. El laboratorio de Steinman ha sido pionero en ratones y monos en que el dsRNA es un adyuvante superior para la inmunidad mediada por células T en relación con varios agonistas de PRR (Longhi et al., 2009; Stahl-Hennig et al., 2009). Un mecanismo importante es que el poli IC es un inductor superior del interferón [IFN] de tipo I sistémico, que a su vez actúa sobre los receptores de IFN de tipo I [IFNAR] para madurar la función inmunoestimuladora de las células dendríticas [DC]. Se induce una respuesta adaptativa de células T de tipo Th1, pero es independiente de IL-12 e IFN-g.

Los enfoques multiparamétricos ahora proporcionan los medios para comprender la acción adyuvante. Presumimos que las CD experimentan cambios que son específicos del adyuvante y luego se vinculan de forma innata a formas seleccionadas de inmunidad adaptativa. Las matrices transcripcionales de DC esplénicas en ratones muestran que el dsRNA induce una respuesta masiva con ~1000 genes de DC esplénicas que cambian > 2 veces en 4 horas. Estos cambios son impulsados ​​principalmente a través de IFN tipo I, producidos sistémicamente a través de MDA-5 en células no derivadas de médula ósea y luego actúan sobre DC IFNAR. IFNAR media la mayoría de los cambios denominados "maduración de DC" y adquisición de actividad inmunoestimulante, por ejemplo, CD86, CD40, IL-15 altos y mecanismos para restaurar la homeostasis. En otras palabras, IFN, en lugar de PRR per se, representa la mayor parte de la respuesta de poli IC en los países en desarrollo.

En un estudio de fase I finalizado recientemente (protocolo MAC-682), se descubrió que poli ICLC era seguro y bien tolerado cuando se administraba como una dosis única de 1,6 mg por vía subcutánea (s.c.) e intranasal (i.n.) a voluntarios sanos. Los datos preliminares de la respuesta inmunitaria innata muestran, de manera similar a los estudios preclínicos en ratones, una marcada regulación al alza de la expresión génica en PBMC completas después de la inyección s.c. de poli ICLC. En el día 1 después de la inyección de poli ICLC, más de 2000 genes están regulados al alza (cambio de expresión > 1,3 veces en el día 1 en comparación con el valor inicial) y estas respuestas son específicas del fármaco del estudio. Es importante destacar que los cambios genéticos son homogéneos entre los 8 voluntarios que recibieron poli ICLC. Los genes más regulados al alza son genes estimulados por interferón, como cabría esperar, ya que se sabe que poli ICLC induce interferones de tipo I. Además, los genes asociados con la activación de las células dendrítricas (DC), como CD40 y CD86, también aumentan el día 1 después de la inyección de poli ICLC, así como los genes involucrados en las vías de señalización como IRF 5, IRF 7 y STAT1. Poly ICLC indujo la secreción de pequeñas cantidades de interferones de tipo I y II en plasma y estos niveles alcanzaron su punto máximo el día 2 después de la inyección. Por último, el análisis FACS de PBMC demostró que poli ICLC indujo una regulación positiva de los marcadores de activación en diferentes subconjuntos de células dendríticas sanguíneas. Actualmente se están realizando evaluaciones de puntos de tiempo posteriores, pero los análisis de muestras del día 7 muestran que los genes involucrados en la generación de respuestas de células T y B están regulados al alza y los genes tempranos estimulados por interferón tienen una tendencia descendente a los niveles de expresión de referencia. Estos resultados hasta ahora muestran que la inyección subcutánea de poli ICLC condujo a respuestas inmunitarias innatas sistémicas, dominadas por la inducción de interferones de tipo I. Se han realizado ensayos en PBMC completas; sin embargo, quedan por definir los patrones de expresión genética de diferentes subconjuntos de leucocitos sanguíneos en respuesta a poli ICLC. Ahora proponemos ampliar el análisis de las respuestas inmunitarias sistémicas después de poli ICLC a la caracterización de sus efectos transcripcionales en tipos específicos de células sanguíneas clasificadas por FACS, como DC, monocitos, células NK y células T y B. Mediante el análisis de subconjuntos de células individuales, esperamos diseccionar mejor cómo poly ICLC modula las respuestas inmunitarias innatas que, a su vez, pueden afectar las respuestas inmunitarias adaptativas cuando se administran en combinación con un antígeno.

La regulación significativa de los genes de interferón (tanto IFN tipo I como IFN-gamma) no fue evidente mediante el análisis de matriz de genes de PBMC completos, a pesar de la medición de pequeñas cantidades tanto de IFN-alfa como de IFN-gamma en plasma. Puede ser que la plataforma utilizada no fuera lo suficientemente sensible para detectar la regulación de los genes de IFN y planeamos realizar una RT-PCR para verificar estos hallazgos. Sin embargo, puede ser que cuando restringimos nuestro análisis a la sangre periférica, pasemos por alto los primeros eventos que tienen lugar después de la administración de poli ICLC. Para comprender cómo poly ICLC activa diferentes poblaciones celulares, es importante caracterizar sus efectos inmunorreguladores tanto a nivel local como sistémico.

El entorno inmunitario cutáneo es particularmente susceptible a la modulación del ligando PRR, como lo demuestra el imiquimod, que actúa sobre TLR 7. De hecho, se ha documentado el uso de imiquimod para estimular las respuestas inmunitarias contra agentes infecciosos (VPH) y malignidad (carcinoma de células escamosas y basales). . Se ha demostrado que las DC migratorias, que pasan de la piel a la piel que drena el NL, cruzan las respuestas inmunitarias primarias a los antígenos propios y virales. Como tal, es posible que las CD de la piel puedan migrar a los LN que drenan la piel o a la sangre después de la administración de poli ICLC. Sin embargo, el análisis de las poblaciones sanguíneas por sí solo probablemente perderá la ventana de alteración inmunológica si estos eventos ocurren localmente en la piel. El análisis de la expresión genética y de los infiltrados celulares en el lugar de la inyección de poli ICLC, tanto al principio (a las 6 horas) como cuando la infiltración de la piel es clínicamente evidente (el día 1), probablemente contribuirá a nuestra comprensión de sus efectos adyuvantes. Los perfiles de expresión genómica de muestras de piel se han utilizado con éxito para la clasificación de enfermedades y para predecir la respuesta al tratamiento en enfermedades de la piel como la psoriasis y el carcinoma de células escamosas (Zaba L et al., 2007; Suarez-Farinas et al., 2010). El análisis del perfil de expresión genómica en la piel después de poli ICLC puede resultar útil para comprender cómo los ligandos de PRR y quizás otros adyuvantes de vacunas inician las respuestas inmunitarias innatas.

La mayoría de los estudios de poli ICLC en humanos utilizaron la vía de administración intramuscular. La administración subcutánea de poli ICLC no se ha estudiado de forma exhaustiva y el protocolo MAC-682 fue el primer estudio en utilizar esta vía de administración en voluntarios sanos. Siguiendo poli ICLC s.c. inyección, 8 de 8 voluntarios desarrollaron un área bien definida de eritema, con cierto grado de endurecimiento y sensibilidad. Esta reacción en el lugar de la inyección suele alcanzar su punto máximo en el día 2 y se resuelve por completo en el día 7. Los datos histológicos que caracterizan este infiltrado no están disponibles en humanos. Sin embargo, los datos están disponibles en primates no humanos.

Se realizó un estudio de toxicología compatible con GLP en macacos cynomolgus para investigar la seguridad de anti-DEC-205 (3G9) - HIV gag p24 (DCVax-001) en combinación con el adyuvante Hiltonol (poly ICLC) por vía subcutánea. En este estudio, a los macacos se les administró un total de cuatro dosis de 10 mg de anticuerpo anti-DEC-205-HIV gag p24 en combinación con 2 mg de poli ICLC, 10 mg de poli ICLC solo o placebo, durante 8 semanas. Con respecto a la reactogenicidad (puntuación de Draize modificada), había pruebas que indicaban que poli ICLC (10 mg) inducía una reacción muy leve y transitoria en el lugar de la inyección en forma de eritema; sin embargo, la reacción se redujo o estuvo ausente con dosis repetidas, lo que indica que tuvo una importancia toxicológica mínima. En el sitio de administración más reciente antes de la eutanasia, 1 día después de la inyección de poli ICLC, se presentaron varias lesiones macroscópicas, incluidas áreas oscuras, decoloración oscura o material gelatinoso. Al menos uno de estos hallazgos ocurrió en todos los animales de ambos sexos que recibieron 10 mg de poli-ICLC. Microscópicamente, estos se asociaron con hemorragia y/o presencia de material extraño extracelular o intracelular (dentro de los macrófagos) que se suponía que representaba predominantemente adyuvante/artículo de prueba. Por lo tanto, las lesiones se consideraron consistentes con una reacción local esperada al material extraño en los sitios de inyección. Tras la recuperación (4 semanas después de la inyección), no se observaron hallazgos macroscópicos relacionados con la administración de poli-ICLC. A pesar de las diferencias entre la piel de los primates no humanos y la piel humana, esperamos encontrar una infiltración celular transitoria similar en el sitio de poli ICLC s.c. inyección.

Además de su papel en la inmunidad antitumoral y viral mencionada anteriormente, el imiquimod tópico se ha utilizado como adyuvante en combinación con la proteína intradérmica NY-ESO-1 en pacientes con melanoma. Esta combinación indujo infiltrados de células mononucleares dérmicas en todos los pacientes. Los infiltrados estaban compuestos principalmente por células T, monocitos, macrófagos, DC mieloides, células NK y, en menor medida, DC plasmocitoides (Adams et al., 2008). Sin embargo, Poly ICLC actúa sobre diferentes PRR, MDA-5 y TLR-3, y probablemente induce la secreción local de IFN de tipo I. Es probable que los efectos inmunomoduladores in situ de poli ICLC difieran de los efectos del imiquimod. La combinación de la evaluación inmunohistoquímica de los infiltrados celulares inducidos por poli ICLC junto con el análisis de matriz de genes de sus efectos transcripcionales en toda la piel desde el lugar de la inyección puede ayudar a dilucidar los eventos y mecanismos locales mediante los cuales poli ICLC ejerce un efecto adyuvante.

Al trabajar con nuestro colaborador, Rafick Sekaly, quien ha utilizado la biología de sistemas para monitorear las respuestas innatas y adaptativas a la vacuna contra la fiebre amarilla y otras cohortes de pacientes (Gaucher et al., 2008), podemos comprender la perturbación adyuvante de la función inmunitaria. Las muestras de sangre y piel recolectadas de los voluntarios del estudio se enviarán al laboratorio del Dr. Sekaly en el Instituto de Vacunas y Terapia Génica, donde se realizarán matrices transcripcionales y análisis bioinformáticos de alto orden para obtener una comprensión global de las respuestas inmunitarias innatas a poli ICLC.

El estudio propuesto es un estudio abierto para evaluar las respuestas inmunitarias innatas poli ICLC inducidas en voluntarios sanos. Los objetivos del estudio son caracterizar los cambios transcripcionales inducidos por la administración subcutánea de poli ICLC en diferentes tipos de células sanguíneas y caracterizar los infiltrados celulares y los cambios transcripcionales en el sitio de inyección de poli ICLC.

Hipótesis primaria La administración de poli ICLC a voluntarios sanos inducirá distintos cambios transcripcionales en diferentes tipos de células sanguíneas, incluidos diferentes subconjuntos de DC.

Hipótesis secundaria La administración de poli ICLC a voluntarios sanos inducirá distintos cambios transcripcionales, y las células T y las células mieloides se infiltrarán en la piel en el lugar de la inyección.

Objetivo principal:

Evaluar las respuestas inmunitarias innatas a poli ICLC en diferentes tipos de células sanguíneas, incluidos tres subconjuntos de células dendríticas después de la administración subcutánea a voluntarios sanos.

Objetivos secundarios:

• Evaluar las respuestas inmunitarias innatas a poli ICLC en el lugar de la inyección.
• Evaluar la reproducibilidad de las respuestas inmunitarias innatas en PBMC completas después de una segunda dosis de poli ICLC, en voluntarios que participaron en el protocolo MAC-682 y ahora vuelven a participar en este estudio propuesto.

Resultado(s) primario(s):

• Matrices transcripcionales en PBMC completas y en 8 subconjuntos de leucocitos sanguíneos (ingenuos y de memoria T, NK, B, monocitos y tres subconjuntos diferentes de células dendríticas (DC plasmocitoides BDCA1+, BDCA3+ y BDCA2+) después de la inyección s.c. administración de poli ICLC.
• Análisis de citometría de flujo de marcadores de activación en diferentes subconjuntos de leucocitos sanguíneos.
• Medición de citoquinas en el suero y/o plasma después de s.c. administración de poli ICLC.

Resultado(s) secundario(s):

• Histología e inmunohistoquímica de rutina para evaluar los infiltrados celulares después de la inyección subcutánea de poli ICLC.
• Análisis transcripcional de muestras de piel del sitio de inyección del fármaco del estudio y de un sitio de piel no lesionado.
• Análisis transcripcional de muestras completas de PBMC en diferentes momentos después de la primera dosis y la segunda dosis de poli ICLC en voluntarios que participaron en el protocolo MAC-682 y ahora regresan para participar en este estudio propuesto.

Métodos y Procedimientos:

Cuestionario de preselección Los participantes potenciales primero se someterán a una preselección por teléfono para evaluar el historial médico y la calificación para el estudio (Apéndice C - Cuestionario de preselección). Los voluntarios potenciales tendrán la oportunidad de discutir el estudio y hacer preguntas al reclutador del estudio en este momento. Aquellos que sean elegibles e interesados ​​en participar asistirán a una visita de evaluación en la Clínica para Pacientes Externos del Hospital Rockefeller.

Visita de selección

Durante la visita de selección, el personal del estudio responderá cualquier pregunta sobre el estudio. Se obtendrá el consentimiento informado por escrito antes de realizar cualquier procedimiento del estudio. Para garantizar el consentimiento informado, el investigador principal o la persona designada discutirá los siguientes procesos y explicaciones individualmente con cada voluntario:

1. Consejería previa a la prueba del VIH.
2. Las voluntarias sexualmente activas deben utilizar un método anticonceptivo fiable desde la selección hasta 6 semanas después de la administración del fármaco.

Si el voluntario acepta participar, el personal del sitio:

• Realizar la historia clínica completa (incluida la medicación concomitante);
• Realizar un examen físico general que incluya altura, peso, signos vitales (pulso, frecuencia respiratoria, presión arterial y temperatura), examen de la piel, sistema respiratorio, cardiovascular y abdominal, y una evaluación de los ganglios linfáticos cervicales y axilares;
• Recoger muestras de sangre y orina para todas las pruebas como se indica en el Programa de Procedimientos (Apéndice A);
• Realice una prueba de embarazo para todas las voluntarias.

Las pruebas de laboratorio de detección pueden repetirse a discreción del investigador principal o su designado para investigar cualquier anormalidad aislada.

Si la visita de selección tiene lugar más de 45 días antes de la fecha de administración del fármaco, se deben repetir los procedimientos del estudio para la visita de selección. Sin embargo, el historial médico completo puede ser reemplazado por un historial médico provisional y el formulario de consentimiento informado puede revisarse sin volver a firmar.

Visita de la Administración de Medicamentos (Día 0)

Antes de la administración del fármaco del estudio, el personal del centro:

• Responder cualquier pregunta sobre el estudio;
• Revisar el historial médico provisional (incluidos los medicamentos concomitantes);
• Revisar los datos de laboratorio de seguridad;
• Revise el formulario de consentimiento informado administrado en la visita de selección con el voluntario;
• Realizar un examen físico dirigido que incluya signos vitales (pulso, frecuencia respiratoria, presión arterial y temperatura), así como una evaluación de los ganglios linfáticos axilares y cualquier examen adicional indicado por la historia o la observación;
• Recoger muestras de sangre y orina para todas las pruebas como se indica en el Programa de Procedimientos (Apéndice A);
• Realice una prueba de embarazo para todas las voluntarias (se enviará sangre inmediatamente) y obtenga los resultados antes de la administración del fármaco.
• Realizar una evaluación inicial del sitio del fármaco del estudio y evaluar y registrar cualquier síntoma sistémico;
• Administrar el fármaco del estudio (los lugares de inyección pueden ser la parte superior de los brazos, los muslos o las nalgas)
• Para los voluntarios que aceptaron someterse a biopsias cutáneas con sacabocados, se realizarán dos biopsias cutáneas con sacabocados: una en un sitio de la piel contralateral al sitio de la inyección y la otra en el sitio de la inyección, 6 horas después de la administración del fármaco del estudio. Los dos sitios de piel seleccionados para la biopsia se limpiarán con povidona yodada y se anestesiarán con una inyección de 1-2% de xilocaína. También se puede aplicar una crema anestésica tópica L.M.X.4 (lidocaína al 4%). Se extraerán dos biopsias con sacabocados de piel (6 mm). Las heridas se suturarán y se aplicarán vendajes estériles. Este procedimiento deja una cicatriz pequeña y permanente.
• El voluntario tendrá la opción de pasar la noche en el hospital la noche anterior a la administración del fármaco del estudio o del placebo y/o el día de la administración del fármaco del estudio por conveniencia ("internos") o ser programado como paciente de día.

Los voluntarios serán observados de cerca durante al menos 30 a 45 minutos después de la administración del fármaco. Se controlarán y registrarán los signos vitales (pulso, frecuencia respiratoria, presión arterial y temperatura) entre 30 y 45 minutos después de la vacunación. Cualquier evento de reactogenicidad local y sistémica, así como cualquier otro evento que ocurra, se registrará a los 30 - 45 minutos. Los voluntarios recibirán una tarjeta de diario (Apéndice B) y se les pedirá que registren cualquier evento de reactogenicidad que ocurra el primer día después de la administración del fármaco y entre los días 1 y 3 y entre los días 3 y 7. El personal del sitio explicará al voluntario cómo registrar la reactogenicidad. eventos.

Se realizarán fotografías médicas para documentar el lugar de la inyección y los cambios posteriores a la inyección, si los hubiere. La identidad del voluntario se mantendrá confidencial.

Día 1 Visita posterior a la administración de medicamentos

• Revisión del historial médico interino y uso de medicamentos concomitantes;
• Si hay síntomas, realice un examen físico dirigido por los síntomas;
• Evaluar la reactogenicidad local y sistémica, así como cualquier otro evento adverso;
• Recolecte muestras de sangre y orina para todas las pruebas como se indica en el Programa de procedimientos (Apéndice A).
• Para los voluntarios que aceptaron someterse a biopsias de piel con sacabocados, se realizará una biopsia de piel con sacabocados adicional 1 día después de la administración del fármaco del estudio, en el lugar de la inyección. El sitio de la piel seleccionado para la biopsia se limpiará con povidona yodada y se anestesiará con una inyección de 1-2% de xilocaína. También se puede aplicar una crema anestésica tópica L.M.X.4 (lidocaína al 4%). Se extraerá una biopsia de piel con sacabocados (6 mm). Se suturará la herida y se aplicará un vendaje estéril. Este procedimiento deja una cicatriz pequeña y permanente.

Visitas posteriores a la administración de medicamentos

Se pedirá a los voluntarios que regresen a la clínica 2, 3 y 7 días después de la administración del fármaco del estudio. En esos días se llevará a cabo lo siguiente:

• Revisión del historial médico interino y uso de medicamentos concomitantes;
• Si hay síntomas, realice un examen físico dirigido por los síntomas;
• Evaluar la reactogenicidad local y sistémica, así como cualquier otro evento adverso;
• Recoger muestras de sangre y orina para todas las pruebas como se indica en el Programa de Procedimientos (Apéndice A);

Visita de seguimiento

En la Semana 2, se pedirá a los voluntarios que regresen a la clínica para una evaluación adicional de seguridad e inmunogenicidad. En esta visita se llevará a cabo lo siguiente:

• Revisión del historial médico interino y uso de medicamentos concomitantes;
• Si hay síntomas, realice un examen físico dirigido por los síntomas;
• Evaluar cualquier evento adverso;
• Recoger muestras de sangre y orina para todas las pruebas como se indica en el Programa de Procedimientos (Apéndice A);
• Retiro de suturas después de biopsias de piel opcionales, si se realizan biopsias.

Las muestras no se enviarán a nuestro colaborador, el Dr. Rafick Sekaly hasta que su aprobación por el IRB sea aceptada y revisada por el IRB de Rockefeller.