Polyinosin-polycytidylsyre-poly-L-lysin Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) hos raske frivillige

Denne protokol vil tage en systembiologisk tilgang til at forstå et vigtigt nyt område inden for vaccinebiologi hos mennesker: mekanismen, hvorved adjuvanser, der virker på definerede mønstergenkendelsesreceptorer [PRR], forbedrer T- og B-celleimmunitet. Vores fokus er på syntetisk dobbeltstrenget RNA, eller poly IC og dens mere RNase-resistente form, kaldet poly ICLC, som er tilgængelig for undersøgelser på mennesker. PRR'erne er den cytosoliske helicase, MDA-5, og den endosomale toll-lignende receptor, TLR3. Steinman-laboratoriet har været pioner inden for mus og aber, at dsRNA er en overlegen adjuvans for T-cellemedieret immunitet i forhold til adskillige PRR-agonister (Longhi et al., 2009; Stahl-Hennig et al., 2009). En vigtig mekanisme er, at poly IC er en overlegen inducer af systemisk type I interferon [IFN], som igen virker på type I IFN receptorer [IFNAR] for at modne immunstimulerende funktion af dendritiske celler [DC'er]. En adaptiv Th1 type T-cellerespons induceres, men den er uafhængig af IL-12 og IFN-g.

Multiparameter-tilgange giver nu midlerne til at forstå adjuverende virkning. Vi antager, at DC'er gennemgår ændringer, der er adjuvansspecifikke og derefter forbinder medfødte til udvalgte former for adaptiv immunitet. Transkriptionelle arrays af milt-DC'er i mus viser, at dsRNA inducerer et massivt respons med ~1000 milt-DC-gener, der ændrer sig > 2 gange på 4 timer. Disse ændringer drives primært via type I IFN, produceret systemisk via MDA-5 i ikke-knoglemarvs-afledte celler og derefter virker på DC IFNAR. IFNAR medierer de fleste ændringer kaldet "DC-modning" og erhvervelse af immunstimulerende aktivitet, f.eks. høj CD86, CD40, IL-15 og mekanismer til at genoprette homeostase. Med andre ord, IFN snarere end PRR i sig selv, tegner sig for hovedparten af ​​poly IC-responsen i DC'er.

I et nyligt afsluttet fase I-studie (protokol MAC-682) blev poly ICLC fundet at være sikker og veltolereret, når den administreres som en enkelt dosis på 1,6 mg subkutant (s.c.) og intranasalt (i.n.) til raske frivillige. Foreløbige medfødte immunresponsdata viser, i lighed med prækliniske undersøgelser i mus, markant opregulering af genekspression i hele PBMC'er efter s.c. injektion af poly ICLC. På dag 1 efter poly ICLC-injektion er over 2.000 gener opreguleret (> 1,3 gange ændring af ekspression på dag 1 versus ved baseline), og disse responser er specifikke for undersøgelseslægemidlet. Det er vigtigt, at genændringer er homogene blandt de 8 frivillige, der modtog poly ICLC. De øverste opregulerede gener er interferon-stimulerede gener, som det ville blive forudsagt, da poly ICLC er kendt for at inducere type I interferoner. Derudover opreguleres gener forbundet med dendritriske celle (DC) aktivering såsom CD40 og CD86 også på dag 1 efter poly ICLC injektion, såvel som gener involveret i signalveje såsom IRF 5, IRF 7 og STAT1. Poly ICLC inducerede sekretion af små mængder af type I og II interferoner i plasma, og disse niveauer toppede på dag 2 efter injektion. Endelig viste FACS-analyse af PBMC'er, at poly ICLC inducerede opregulering af aktiveringsmarkører på forskellige undergrupper af bloddendritiske celler. Evaluering af senere tidspunkter finder i øjeblikket sted, men analyser af prøver fra dag 7 viser, at gener involveret i genereringen af ​​T- og B-celle-responser er opreguleret, og de tidlige interferon-stimulerede gener er på vej ned til baseline-ekspressionsniveauer. Disse resultater viser indtil videre, at subkutan injektion af poly ICLC førte til systemiske medfødte immunresponser, domineret af induktion af type I interferoner. Assays er blevet udført i hele PBMC'er, men genetiske ekspressionsmønstre for forskellige undergrupper af blodleukocytter som reaktion på poly ICLC er endnu ikke defineret. Vi foreslår nu at udvide analysen af ​​systemiske immunresponser efter poly ICLC til karakterisering af dens transkriptionelle virkninger på specifikke FACS-sorterede blodcelletyper, såsom DC'er, monocytter, NK-celler samt T- og B-celler. Ved at analysere individuelle celleundergrupper forventer vi bedre at dissekere, hvordan poly ICLC modulerer medfødte immunresponser, som igen kan påvirke adaptive immunresponser, når de gives i kombination med et antigen.

Signifikant regulering af interferon-gener (både type I IFN'er og IFN-gamma) var ikke tydelig ved genarray-analyse af hele PBMC'er, på trods af måling af små mængder af både IFN-alfa og IFN-gamma i plasma. Det kan være, at den anvendte platform ikke var følsom nok til at detektere regulering af IFN-gener, og vi planlægger at udføre RT-PCR for at verificere disse fund. Det kan dog være, at når vi begrænser vores analyse til perifert blod, går vi glip af de tidlige hændelser, der finder sted efter poly ICLC-administration. For at forstå, hvordan poly ICLC aktiverer forskellige cellepopulationer, er det vigtigt at karakterisere dens immunregulerende virkninger både lokalt og systemisk.

Det kutane immunmiljø er særligt modtageligt for PRR-ligandmodulering, som det fremgår af imiquimod, som virker på TLR 7. Faktisk er brug af imiquimod til at stimulere immunresponser mod både infektiøse agenser (HPV) og malignitet (pladecelle- og basalcellecarcinom) blevet dokumenteret . Migrerende DC'er, som transporterer fra huden til huden og dræner LN, har vist sig at krydse primære immunreaktioner til selv- og virale antigener. Som sådan er det muligt, at hud-DC'er kan migrere ind i huddrænende LN'er eller blod efter poly ICLC-administration. Alene analyse af blodpopulationer vil dog sandsynligvis gå glip af vinduet med immunændringer, hvis disse hændelser forekommer lokalt i huden. Analyse af genetisk ekspression og cellulære infiltrater på stedet for poly ICLC-injektion, både tidligt (ved 6 timer) og når hudinfiltration er tydelig klinisk (på dag 1), vil sandsynligvis bidrage til vores forståelse af dets adjuvansvirkninger. Genomiske ekspressionsprofiler af hudprøver er med succes blevet brugt til sygdomsklassificering og til at forudsige respons på behandling af hudsygdomme såsom psoriasis og pladecellekarcinom (Zaba L et al., 2007; Suarez-Farinas et al., 2010). Analyse af genomisk ekspressionsprofil i hud efter poly ICLC kan vise sig nyttig til at forstå, hvordan medfødte immunresponser initieres af PRRs-ligander og måske af andre vaccineadjuvanser.

De fleste undersøgelser af poly ICLC hos mennesker brugte den intramuskulære administrationsvej. Subkutan administration af poly ICLC er ikke blevet undersøgt grundigt, og protokol MAC-682 var den første undersøgelse, der brugte denne administrationsvej til raske frivillige. Efter poly ICLC s.c. injektion udviklede 8 ud af 8 frivillige et veldefineret område med erytem med en vis grad af induration og ømhed. Denne reaktion på injektionsstedet topper sædvanligvis på dag 2 og er fuldstændig forsvundet på dag 7. Histologiske data, der karakteriserer dette infiltrat, er ikke tilgængelige hos mennesker. Data er dog tilgængelige for ikke-menneskelige primater.

En GLP-kompatibel toksikologisk undersøgelse blev udført i cynomolgus makakaber for at undersøge sikkerheden af ​​anti-DEC-205 (3G9) - HIV gag p24 (DCVax-001) i kombination med adjuvansen Hiltonol (poly ICLC) subkutant. I denne undersøgelse blev makakaber administreret i alt fire doser af 10 mg anti-DEC-205-HIV gag p24-antistof i kombination med 2 mg poly ICLC, 10 mg poly ICLC alene eller placebo, over 8 uger. Med hensyn til reaktogenicitet (modificeret Draize-scoring) var der bevis for, at poly ICLC (10 mg) inducerede meget let og forbigående reaktion på injektionsstedet i form af erytem; reaktionen var imidlertid reduceret eller fraværende ved gentagen dosering, hvilket indikerer, at den var af minimal toksikologisk betydning. En række alvorlige læsioner, inklusive mørke områder, mørk misfarvning eller gelatinøst materiale, var til stede på det seneste administrationssted før eutanasi, 1 dag efter poly ICLC-injektion. Mindst et af disse fund forekom hos alle dyr af begge køn, der modtog 10 mg poly-ICLC. Mikroskopisk var disse associeret med blødning og/eller tilstedeværelse af ekstracellulært eller intracellulært (indenfor makrofager) fremmedmateriale, der formodes at repræsentere overvejende adjuvans/testartikel. Læsionerne blev derfor anset for at være i overensstemmelse med en forventet lokal reaktion på fremmedmateriale på injektionsstederne. Efter bedring (4 uger efter injektion) blev der ikke noteret makroskopiske fund relateret til administration af poly-ICLC. På trods af forskelle mellem huden på ikke-menneskelige primater og menneskelig hud, forventer vi at finde lignende forbigående cellulær infiltration på stedet for poly ICLC s.c. indsprøjtning.

Ud over dets rolle i antitumor og viral immunitet nævnt ovenfor, er topisk imiquimod blevet brugt som en adjuvans i kombination med intradermalt NY-ESO-1-protein hos melanompatienter. Denne kombination inducerede dermale mononukleære celleinfiltrater hos alle patienter. Infiltraterne var primært sammensat af T-celler, monocytter, makrofager, myeloid DC'er, NK-celler og i mindre grad plasmacytoide DC'er (Adams et al., 2008). Poly ICLC virker imidlertid på forskellige PRR'er, MDA-5 og TLR-3, og inducerer sandsynligvis sekretion af type-I IFN'er lokalt. In situ immunmodulerende virkninger af poly ICLC vil sandsynligvis adskille sig fra virkningerne af imiquimod. Kombination af immunhistokemi-evaluering af de cellulære infiltrater induceret af poly ICLC sammen med genarray-analyse af dets transkriptionelle virkninger på hel hud fra injektionsstedet kan hjælpe med at belyse de lokale hændelser og mekanismer, hvorved poly ICLC udøver en adjuvanseffekt.

Ved at arbejde sammen med vores samarbejdspartner, Rafick Sekaly, som har brugt systembiologi til at overvåge medfødte og adaptive reaktioner på gul feber-vaccine og andre patientkohorter (Gaucher et al., 2008), kan vi forstå adjuverende forstyrrelse af immunfunktionen. Blod- og hudprøver indsamlet fra undersøgelsens frivillige vil blive sendt til Dr. Sekalys laboratorium på Vaccine and Gen Therapy Institute, hvor transkriptionelle arrays og bioinformatiske analyser af høj orden vil blive udført for at opnå en global forståelse af de medfødte immunresponser på poly ICLC.

Det foreslåede studie er et åbent studie for at evaluere de medfødte immunresponser induceret poly ICLC hos raske frivillige. Formålet med undersøgelsen er at karakterisere de transkriptionelle ændringer induceret af subkutan administration af poly ICLC på forskellige blodcelletyper og at karakterisere de cellulære infiltrater og transkriptionelle ændringer på stedet for poly ICLC injektion.

Primær hypotese Administration af poly ICLC til raske frivillige vil inducere distinkte transkriptionelle ændringer i forskellige blodcelletyper, herunder forskellige undergrupper af DC'er.

Sekundær hypotese Administration af poly ICLC til raske frivillige vil inducere tydelige transkriptionelle ændringer, og T-celler og myeloidceller infiltrerer i huden på injektionsstedet.

Primært mål:

At evaluere de medfødte immunresponser på poly ICLC i forskellige blodcelletyper, herunder tre undergrupper af dendritiske celler efter subkutan administration til raske frivillige.

Sekundære mål:

• At evaluere de medfødte immunresponser på poly ICLC på injektionsstedet.
• For at evaluere reproducerbarheden af ​​medfødte immunresponser i hele PBMC'er efter en anden dosis poly ICLC, hos frivillige, der deltog i protokol MAC-682 og nu vender tilbage for at deltage i denne foreslåede undersøgelse.

Primære resultater:

• Transkriptionelle arrays i hele PBMC'er og i 8 undergrupper af blodleukocytter (naive og hukommelses-T, NK, B, monocytter og tre forskellige undergrupper af dendritiske celler (BDCA1+, BDCA3+ og BDCA2+ plasmacytoide DC'er) efter s.c. administration af poly ICLC.
• Flowcytometrisk analyse af aktiveringsmarkører i forskellige undergrupper af blodleukocytter.
• Måling af cytokiner i serum og/eller plasma efter s.c. administration af poly ICLC.

Sekundære resultater:

• Rutinemæssig histologi og immunhistokemi til evaluering af cellulære infiltrater efter subkutan injektion af poly ICLC.
• Transkriptionel analyse af hudprøver fra undersøgelseslægemidlets injektionssted og fra et ikke-læsionssted i huden.
• Transkriptionel analyse af hele PBMC-prøver på forskellige tidspunkter efter den første dosis og den anden dosis af poly ICLC hos frivillige, som deltog i protokol MAC-682 og nu vender tilbage for at deltage i denne foreslåede undersøgelse.

Metoder og procedurer:

Pre-screening spørgeskema Potentielle deltagere vil først gennemgå præ-screening via telefon for at vurdere sygehistorie og kvalifikation til undersøgelsen (bilag C - Pre-screening spørgeskema). Potentielle frivillige vil have mulighed for at diskutere undersøgelsen og stille spørgsmål til undersøgelsesrekruttereren på dette tidspunkt. De, der er berettigede og interesserede i at deltage, vil deltage i et screeningsbesøg på Rockefeller Hospitals ambulatorium.

Screeningsbesøg

Under screeningsbesøget vil undersøgelsens personale besvare eventuelle spørgsmål om undersøgelsen. Der vil blive indhentet skriftligt informeret samtykke inden udførelse af undersøgelsesprocedurer. For at sikre informeret samtykke vil hovedefterforskeren eller den udpegede leder diskutere følgende processer og forklaringer individuelt med hver frivillig:

1. Rådgivning før HIV-test.
2. Seksuelt aktive frivillige bør bruge en pålidelig form for prævention fra screening til 6 uger efter lægemiddeladministration.

Hvis den frivillige giver samtykke til at deltage, vil stedets personale:

• Udfør fuldstændig sygehistorie (inklusive samtidig medicinering);
• Udfør en generel fysisk undersøgelse, herunder højde, vægt, vitale tegn (puls, respirationsfrekvens, blodtryk og temperatur), undersøgelse af hud, åndedræt, kardiovaskulære og abdominale systemer og en vurdering af cervikale og aksillære lymfeknuder;
• Saml blod- og urinprøver til alle tests som angivet i skemaet for procedurer (tillæg A);
• Udfør en graviditetstest for alle kvindelige frivillige.

Screeninglaboratorietest(s) kan gentages efter den primære investigators eller den udpegede persons skøn for at undersøge eventuelle isolerede abnormiteter.

Hvis screeningsbesøget finder sted mere end 45 dage før datoen for lægemiddeladministration, skal undersøgelsesprocedurerne for screeningsbesøget gentages. Den fuldstændige sygehistorie kan dog erstattes af en midlertidig sygehistorie, og formularen til informeret samtykke kan gennemgås uden underskrift igen.

Lægemiddeladministrationsbesøg (dag 0)

Inden administrationen af ​​undersøgelseslægemidlet skal personalet på stedet:

• Besvar eventuelle spørgsmål om undersøgelsen;
• Gennemgå midlertidig sygehistorie (inklusive samtidig medicin);
• Gennemgå sikkerhedslaboratoriedata;
• Gennemgå den informerede samtykkeformular, der blev administreret ved screeningsbesøget med en frivillig;
• Udfør en rettet fysisk undersøgelse inklusive vitale tegn (puls, respirationsfrekvens, blodtryk og temperatur) samt en vurdering af aksillære lymfeknuder og enhver yderligere undersøgelse angivet ved historie eller observation;
• Saml blod- og urinprøver til alle tests som angivet i skemaet for procedurer (tillæg A);
• Udfør en graviditetstest for alle kvindelige frivillige (blod vil blive sendt statistisk) og opnå resultater før lægemiddeladministration
• Udfør baseline vurdering af stedet for undersøgelseslægemidlet og evaluer og registrer eventuelle systemiske symptomer;
• Administrer undersøgelseslægemiddel (injektionssteder kan være overarme, lår eller balder)
• For frivillige, som har accepteret at gennemgå hudpunch-biopsier, vil der blive udført to hudpunch-biopsier: en på et hudsted kontralateralt til injektionsstedet og den anden på injektionsstedet, 6 timer efter administration af undersøgelseslægemidlet. De to udvalgte hudsteder til biopsi vil blive renset med povidon-jod og bedøvet ved injektion af 1-2 % xylocain. L.M.X.4 (Lidocaine 4%) en topisk anæstetisk creme kan også påføres. To punchbiopsier af hud (6 mm) vil blive fjernet. Sårene vil blive syet og steril bandage påført. Denne procedure efterlader et lille og permanent ar.
• Den frivillige vil have mulighed for at blive på hospitalet natten over natten før studiemedicin eller placeboadministration og/eller dagen for studiemedicinadministration for nemheds skyld ("boarders") eller være planlagt som dagpatient

Frivillige vil blive observeret nøje i mindst 30 - 45 minutter efter lægemiddeladministration. Vitale tegn (puls, respirationsfrekvens, blodtryk og temperatur) vil blive overvåget 30 - 45 minutter efter vaccination og registreret. Eventuelle lokale og systemiske reaktogenicitetsbegivenheder, såvel som enhver anden hændelse, der opstår, vil blive registreret efter 30 - 45 minutter. Frivillige vil få udleveret et dagbogskort (bilag B) og bedt om at registrere eventuelle reaktogenicitetsbegivenheder, der opstår den første dag efter lægemiddeladministration og mellem dag 1 og 3 og mellem dag 3 og 7. Personalet på stedet vil forklare den frivillige, hvordan man registrerer reaktogenicitet begivenheder.

Medicinsk fotografering vil blive udført for at dokumentere injektionsstedet og eventuelle ændringer efter injektion. Den frivilliges identitet vil blive holdt fortrolig.

Dag 1 Post-Drug Administration Besøg

• Gennemgang af midlertidig sygehistorie og brug af samtidig medicin;
• Hvis symptomer er til stede, skal du udføre en symptomstyret fysisk undersøgelse;
• Vurder lokal og systemisk reaktogenicitet såvel som andre uønskede hændelser;
• Saml blod- og urinprøver til alle tests som angivet i procedureskemaet (tillæg A).
• For frivillige, der har accepteret at gennemgå hudpunch-biopsier, vil der blive udført en ekstra hudpunch-biopsi 1 dag efter indgivelse af undersøgelseslægemidlet på injektionsstedet. Det valgte hudsted til biopsi vil blive renset med povidon-jod og bedøvet ved injektion af 1-2 % xylocain. L.M.X.4 (Lidocaine 4%) en topisk anæstetisk creme kan også påføres. En punch-biopsi af huden (6 mm) vil blive fjernet. Såret vil blive syet og steril bandage påført. Denne procedure efterlader et lille og permanent ar.

Besøg efter lægemiddeladministration

Frivillige vil blive bedt om at vende tilbage til klinikken 2, 3 og 7 dage efter indgivelse af studiemedicin. På disse dage vil følgende blive gennemført:

• Gennemgang af midlertidig sygehistorie og brug af samtidig medicin;
• Hvis symptomer er til stede, skal du udføre en symptomstyret fysisk undersøgelse;
• Vurder lokal og systemisk reaktogenicitet såvel som andre uønskede hændelser;
• Saml blod- og urinprøver til alle tests som angivet i skemaet for procedurer (tillæg A);

Opfølgningsbesøg

I uge 2 vil frivillige blive bedt om at vende tilbage til klinikken for en yderligere vurdering af sikkerhed og immunogenicitet. Følgende vil blive gennemført ved dette besøg:

• Gennemgang af midlertidig sygehistorie og brug af samtidig medicin;
• Hvis symptomer er til stede, skal du udføre en symptomstyret fysisk undersøgelse;
• Vurder eventuelle uønskede hændelser;
• Saml blod- og urinprøver til alle tests som angivet i skemaet for procedurer (tillæg A);
• Suturfjernelse efter valgfri hudbiopsier, hvis der udføres biopsier.

Prøver vil ikke blive sendt til vores samarbejdspartner, Dr. Rafick Sekaly, før hans IRB-godkendelse er accepteret og gennemgået af Rockefellers IRB.