Polyinosin-polycytidylsyre-poly-L-lysin Karboksymetylcellulose (Poly-ICLC) hos friske frivillige

Denne protokollen vil ta en systembiologisk tilnærming for å forstå et stort nytt område innen vaksinebiologi hos mennesker: mekanismen der adjuvanser, som virker på definerte mønstergjenkjenningsreseptorer [PRR], forbedrer T- og B-celleimmunitet. Vårt fokus er på syntetisk dobbelttrådet RNA, eller poly IC og dens mer RNase-resistente form, kalt poly ICLC, som er tilgjengelig for studier på mennesker. PRR-ene er den cytosoliske helikase, MDA-5, og den endosomale tolllignende reseptoren, TLR3. Steinman-laboratoriet har vært pioner innen mus og aper at dsRNA er en overlegen adjuvans for T-cellemediert immunitet i forhold til flere PRR-agonister (Longhi et al., 2009; Stahl-Hennig et al., 2009). En hovedmekanisme er at poly IC er en overlegen induser av systemisk type I interferon [IFN], som igjen virker på type I IFN-reseptorer [IFNAR] for å modne immunstimulerende funksjon av dendritiske celler [DCs]. En adaptiv Th1 type T-cellerespons induseres, men den er uavhengig av IL-12 og IFN-g.

Multiparametertilnærminger gir nå midler til å forstå adjuvansvirkning. Vi antar at DC-er gjennomgår endringer som er adjuvansspesifikke og deretter kobler medfødt til utvalgte former for adaptiv immunitet. Transkripsjonelle arrayer av milt-DC-er i mus viser at dsRNA induserer en massiv respons med ~1000 milt-DC-gener som endrer seg > 2 ganger på 4 timer. Disse endringene drives primært via type I IFN, produsert systemisk via MDA-5 i ikke-benmargsavledede celler og virker deretter på DC IFNAR. IFNAR medierer de fleste endringer kalt "DC-modning" og tilegnelse av immunstimulerende aktivitet, f.eks. høy CD86, CD40, IL-15 og mekanismer for å gjenopprette homeostase. Med andre ord, IFN snarere enn PRR i seg selv, står for hoveddelen av poly IC-responsen i DC-er.

I en nylig fullført fase I-studie (protokoll MAC-682), ble poly ICLC funnet å være trygg og godt tolerert når den ble administrert som en enkeltdose på 1,6 mg subkutant (s.c.) og intranasalt (i.n.) til friske frivillige. Foreløpige medfødte immunresponsdata viser, i likhet med prekliniske studier på mus, markert oppregulering av genuttrykk i hele PBMC-er etter s.c.-injeksjon av poly ICLC. På dag 1 etter poly ICLC-injeksjon er over 2000 gener oppregulert (> 1,3 ganger endring av uttrykk på dag 1 versus ved baseline) og disse responsene er spesifikke for studiemedikamentet. Viktigere er at genforandringer er homogene blant de 8 frivillige som mottok poly ICLC. De øverste oppregulerte genene er interferon-stimulerte gener som det ville bli forutsagt siden poly ICLC er kjent for å indusere type I interferoner. I tillegg er gener assosiert med dendritriske celle (DC) aktivering som CD40 og CD86 også oppregulert på dag 1 etter poly ICLC injeksjon, samt gener involvert i signalveier som IRF 5, IRF 7 og STAT1. Poly ICLC induserte sekresjon av små mengder type I og II interferoner i plasma, og disse nivåene toppet seg på dag 2 etter injeksjon. Til slutt viste FACS-analyse av PBMC-er at poly ICLC induserte oppregulering av aktiveringsmarkører på forskjellige undergrupper av dendritiske blodceller. Evaluering av senere tidspunkter pågår for tiden, men analyser av prøver fra dag 7 viser at gener som er involvert i genereringen av T- og B-celleresponser er oppregulert og de tidlige interferon-stimulerte genene trender ned til basislinjenivåer av uttrykk. Disse resultatene så langt viser at subkutan injeksjon av poly ICLC førte til systemiske medfødte immunresponser, dominert av induksjon av type I interferoner. Analyser har blitt utført i hele PBMC-er, men genetiske ekspresjonsmønstre for forskjellige undergrupper av blodleukocytter som respons på poly ICLC gjenstår å bli definert. Vi foreslår nå å utvide analysen av systemiske immunresponser etter poly ICLC til karakterisering av dens transkripsjonelle effekter på spesifikke FACS-sorterte blodcelletyper, som DC-er, monocytter, NK-celler samt T- og B-celler. Ved å analysere individuelle celleundergrupper forventer vi å bedre dissekere hvordan poly ICLC modulerer medfødte immunresponser som igjen kan påvirke adaptive immunresponser når de gis i kombinasjon med et antigen.

Signifikant regulering av interferon-gener (både type I IFN-er og IFN-gamma) var ikke tydelig ved genarray-analyse av hele PBMC-er, til tross for måling av små mengder av både IFN-alfa og IFN-gamma i plasma. Det kan være at plattformen som ble brukt ikke var sensitiv nok til å oppdage regulering av IFN-gener, og vi planlegger å utføre RT-PCR for å bekrefte disse funnene. Det kan imidlertid hende at når vi begrenser vår analyse til perifert blod, går vi glipp av de tidlige hendelsene som finner sted etter poly ICLC-administrasjon. For å forstå hvordan poly ICLC aktiverer ulike cellepopulasjoner, er det viktig å karakterisere dens immunregulatoriske effekter både lokalt og systemisk.

Det kutane immunmiljøet er spesielt mottagelig for PRR-ligandmodulering som bevist av imiquimod, som virker på TLR 7. Faktisk er bruk av imiquimod for å stimulere immunresponser mot både smittsomme stoffer (HPV) og malignitet (plateepitel- og basalcellekarsinom) dokumentert. . Migrerende DC-er, som transporterer fra huden til huden som drenerer LN, har vist seg å krysse primære immunresponser til selv- og virale antigener. Som sådan er det mulig at hud-DC-er kan migrere inn i huddrenerende LN-er eller blod etter poly ICLC-administrasjon. Imidlertid vil analyse av blodpopulasjoner alene sannsynligvis gå glipp av vinduet med immunforandringer hvis disse hendelsene oppstår lokalt i huden. Analyse av genetisk uttrykk og av cellulære infiltrater på stedet for poly ICLC-injeksjon, både tidlig (ved 6 timer) og når hudinfiltrasjon er tydelig klinisk (på dag 1), vil sannsynligvis bidra til vår forståelse av dens adjuvante effekter. Genomiske ekspresjonsprofiler av hudprøver har blitt brukt med hell for sykdomsklassifisering og for å forutsi respons på behandling ved hudsykdommer som psoriasis og plateepitelkarsinom (Zaba L et al., 2007; Suarez-Farinas et al., 2010). Analyse av genomisk ekspresjonsprofil i hud etter poly ICLC kan vise seg nyttig for å forstå hvordan medfødte immunresponser initieres av PRR-ligander og kanskje av andre vaksineadjuvanser.

De fleste studier av poly ICLC hos mennesker brukte intramuskulær administreringsvei. Subkutan administrering av poly ICLC har ikke blitt studert omfattende, og protokoll MAC-682 var den første studien som brukte denne administreringsmåten hos friske frivillige. Etter poly ICLC s.c. injeksjon utviklet 8 av 8 frivillige et veldefinert område med erytem, ​​med en viss grad av indurasjon og ømhet. Denne reaksjonen på injeksjonsstedet topper seg vanligvis på dag 2 og er fullstendig forsvunnet på dag 7. Histologiske data som karakteriserer dette infiltratet er ikke tilgjengelig hos mennesker. Imidlertid er data tilgjengelig for ikke-menneskelige primater.

En GLP-kompatibel toksikologisk studie ble utført i cynomolgus macaques for å undersøke sikkerheten til anti-DEC-205 (3G9) - HIV gag p24 (DCVax-001) i kombinasjon med adjuvansen Hiltonol (poly ICLC) subkutant. I denne studien ble makaker administrert totalt fire doser på 10 mg anti-DEC-205-HIV gag p24 antistoff i kombinasjon med 2 mg poly ICLC, 10 mg poly ICLC alene eller placebo, over 8 uker. Med hensyn til reaktogenisitet (modifisert Draize-skåring), var det bevis som tyder på at poly ICLC (10 mg) induserte svært liten og forbigående reaksjon på injeksjonsstedet i form av erytem; reaksjonen ble imidlertid redusert eller fraværende ved gjentatt dosering, noe som indikerer at den var av minimal toksikologisk betydning. En rekke grove lesjoner inkludert mørke områder, mørk misfarging eller gelatinøst materiale var tilstede på det siste administrasjonsstedet før eutanasi, 1 dag etter poly ICLC-injeksjon. Minst ett av disse funnene skjedde hos alle dyr av begge kjønn som fikk 10 mg poly-ICLC. Mikroskopisk var disse assosiert med blødning og/eller tilstedeværelse av ekstracellulært eller intracellulært (innenfor makrofager) fremmedmateriale som antas å representere hovedsakelig adjuvans/testartikkel. Lesjonene ble derfor vurdert i samsvar med en forventet lokal reaksjon på fremmedlegemer på injeksjonsstedene. Ved bedring (4 uker etter injeksjon) ble ingen makroskopiske funn relatert til administrering av poly-ICLC notert. Til tross for forskjeller mellom huden til ikke-menneskelige primater og menneskelig hud, forventer vi å finne lignende forbigående cellulær infiltrasjon på stedet for poly ICLC s.c. injeksjon.

I tillegg til sin rolle i antitumor og viral immunitet nevnt ovenfor, har topisk imiquimod blitt brukt som en adjuvans i kombinasjon med intradermalt NY-ESO-1-protein hos melanompasienter. Denne kombinasjonen induserte dermale mononukleære celleinfiltrater hos alle pasienter. Infiltratene var hovedsakelig sammensatt av T-celler, monocytter, makrofager, myeloide DC-er, NK-celler og, i mindre grad, plasmacytoide DC-er (Adams et al., 2008). Poly ICLC virker imidlertid på forskjellige PRRer, MDA-5 og TLR-3, og induserer sannsynligvis sekresjon av type I IFN lokalt. In situ immunmodulerende effekter av poly ICLC vil sannsynligvis avvike fra effekten av imiquimod. Ved å kombinere immunhistokjemi-evaluering av de cellulære infiltratene indusert av poly ICLC sammen med genarray-analyse av dens transkripsjonelle effekter på hele huden fra injeksjonsstedet kan bidra til å belyse de lokale hendelsene og mekanismene der poly ICLC utøver en adjuvanseffekt.

Ved å samarbeide med vår samarbeidspartner, Rafick Sekaly, som har brukt systembiologi for å overvåke medfødte og adaptive responser på gulfebervaksine og andre pasientkohorter (Gaucher et al., 2008), kan vi forstå adjuvant forstyrrelse av immunfunksjonen. Blod- og hudprøver samlet inn fra studiefrivillige vil bli sendt til Dr. Sekalys laboratorium ved Vaccine and Gen Therapy Institute, hvor transkripsjonsmatriser og bioinformatikkanalyser av høy orden vil bli utført for å oppnå en global forståelse av de medfødte immunresponsene på poly ICLC.

Den foreslåtte studien er en åpen studie for å evaluere de medfødte immunresponsene indusert poly ICLC hos friske frivillige. Målet med studien er å karakterisere de transkripsjonelle endringene indusert av subkutan administrering av poly ICLC på forskjellige blodcelletyper og å karakterisere de cellulære infiltratene og transkripsjonelle endringer på stedet for poly ICLC injeksjon.

Primær hypotese Administrering av poly ICLC til friske frivillige vil indusere distinkte transkripsjonsendringer i forskjellige blodcelletyper, inkludert forskjellige undergrupper av DC-er.

Sekundær hypotese Administrering av poly ICLC til friske frivillige vil indusere distinkte transkripsjonelle endringer, og T-celler og myeloidceller infiltrerer huden på injeksjonsstedet.

Primært mål:

For å evaluere de medfødte immunresponsene på poly ICLC i forskjellige blodcelletyper, inkludert tre undergrupper av dendrittiske celler etter subkutan administrering til friske frivillige.

Sekundære mål:

• For å evaluere de medfødte immunresponsene på poly ICLC på injeksjonsstedet.
• For å evaluere reproduserbarheten av medfødte immunresponser i hele PBMC-er etter en andre dose poly ICLC, hos frivillige som deltok i protokoll MAC-682 og nå kommer tilbake for å delta i denne foreslåtte studien.

Primært utfall:

• Transkripsjonsarrayer i hele PBMCer og i 8 undergrupper av blodleukocytter (naive og minne T, NK, B, monocytter og tre forskjellige undergrupper av dendrittiske celler (BDCA1+, BDCA3+ og BDCA2+ plasmacytoide DCs) etter s.c. administrering av poly ICLC.
• Flowcytometrisk analyse av aktiveringsmarkører i forskjellige undergrupper av blodleukocytter.
• Måling av cytokiner i serum og/eller plasma etter s.c. administrering av poly ICLC.

Sekundære utfall:

• Rutinemessig histologi og immunhistokjemi for å evaluere cellulære infiltrater etter subkutan injeksjon av poly ICLC.
• Transkripsjonsanalyse av hudprøver fra injeksjonsstedet for studiemedisin og fra et ikke-lesjonssted i huden.
• Transkripsjonsanalyse av hele PBMC-prøver på forskjellige tidspunkter etter den første dosen og den andre dosen av poly ICLC hos frivillige som deltok i protokollen MAC-682 og nå kommer tilbake for å delta i denne foreslåtte studien.

Metoder og prosedyrer:

Pre-Screening Questionnaire Potensielle deltakere vil først gjennomgå forhåndsscreening via telefon for å vurdere sykehistorie og kvalifikasjoner for studien (vedlegg C - Pre-screening Questionnaire). Potensielle frivillige vil ha muligheten til å diskutere studien og stille spørsmål til studierekruttereren på dette tidspunktet. De som er kvalifisert og interessert i å delta vil delta på et screeningbesøk ved Rockefeller Hospital poliklinikk.

Screening besøk

Under screeningbesøket vil studiepersonell svare på spørsmål om studien. Skriftlig informert samtykke vil bli innhentet før noen studieprosedyrer gjennomføres. For å sikre informert samtykke, vil hovedetterforskeren eller utpekt diskutere følgende prosesser og forklaringer individuelt med hver frivillig:

1. Rådgivning før HIV-test.
2. Seksuelt aktive frivillige bør bruke en pålitelig form for prevensjon fra screening til 6 uker etter legemiddeladministrering.

Hvis den frivillige samtykker til å delta, vil stedets personell:

• Utfør fullstendig medisinsk historie (inkludert samtidig medisinering);
• Utføre en generell fysisk undersøkelse inkludert høyde, vekt, vitale tegn (puls, respirasjonsfrekvens, blodtrykk og temperatur), undersøkelse av hud, respiratoriske, kardiovaskulære og abdominale systemer, og en vurdering av cervikale og aksillære lymfeknuter;
• Samle blod- og urinprøver for alle tester som angitt i prosedyreoversikten (vedlegg A);
• Utfør en graviditetstest for alle kvinnelige frivillige.

Screeninglaboratorietest(er) kan gjentas etter hovedforskerens eller den som er utpekt for å undersøke eventuelle isolerte abnormiteter.

Hvis screeningbesøket finner sted mer enn 45 dager før datoen for legemiddeladministrering, må studieprosedyrene for screeningbesøket gjentas. Den fullstendige sykehistorien kan imidlertid erstattes av en midlertidig sykehistorie, og skjemaet for informert samtykke kan gjennomgås uten å signere på nytt.

Legemiddeladministrasjonsbesøk (dag 0)

Før administrasjonen av studiemedikamentet, vil stedets personell:

• Svar på spørsmål om studiet;
• Gjennomgå midlertidig medisinsk historie (inkludert samtidige medisiner);
• Se gjennom sikkerhetslaboratoriedata;
• Se gjennom skjemaet for informert samtykke som ble administrert ved screeningbesøket med en frivillig;
• Utfør en rettet fysisk undersøkelse inkludert vitale tegn (puls, respirasjonsfrekvens, blodtrykk og temperatur) samt en vurdering av aksillære lymfeknuter og ytterligere undersøkelser indikert av historie eller observasjon;
• Samle blod- og urinprøver for alle tester som angitt i prosedyreoversikten (vedlegg A);
• Utfør en graviditetstest for alle kvinnelige frivillige (blod vil bli sendt stat) og få resultater før legemiddeladministrering
• Utfør baselinevurdering av stedet for studiemedikamentet og evaluer og registrer eventuelle systemiske symptomer;
• Administrer studiemedikament (injeksjonssteder kan være overarmer, lår eller rumpe)
• For frivillige som har samtykket til å gjennomgå hudpunchbiopsier, vil to hudpunchbiopsier bli utført: en på et hudsted kontralateralt til injeksjonsstedet og den andre på injeksjonsstedet, 6 timer etter administrering av studiemedikamentet. De to utvalgte hudstedene for biopsi vil bli renset med povidon-jod og bedøvet ved injeksjon av 1-2 % xylokain. L.M.X.4 (Lidocaine 4%) en lokal anestesikrem kan også påføres. To punchbiopsier av hud (6 mm) vil bli fjernet. Sårene skal sys og steril bandasje påføres. Denne prosedyren etterlater et lite og permanent arr.
• Den frivillige vil ha muligheten til å overnatte på sykehuset natten før studiemedikamentet eller placeboadministrasjonen og/eller dagen for studiemedikamentadministrasjonen for enkelhets skyld ("boarders") eller planlegges som dagpasient

Frivillige vil bli nøye observert i minst 30 - 45 minutter etter legemiddeladministrering. Vitale tegn (puls, respirasjonsfrekvens, blodtrykk og temperatur) vil bli overvåket 30 - 45 minutter etter vaksinasjon og registrert. Eventuelle lokale og systemiske reaktogenisitetshendelser, så vel som enhver annen hendelse som oppstår, vil bli registrert etter 30 - 45 minutter. Frivillige vil bli gitt et dagbokkort (vedlegg B) og bedt om å registrere eventuelle reaktogenisitetshendelser som oppstår den første dagen etter legemiddeladministrering og mellom dag 1 og 3 og mellom dag 3 og 7. Ansatte på stedet vil forklare frivillige hvordan reaktogenisitet skal registreres arrangementer.

Medisinsk fotografering vil bli utført for å dokumentere injeksjonsstedet og eventuelle endringer etter injeksjon. Den frivilliges identitet vil bli holdt konfidensiell.

Dag 1 Post-Drug Administration besøk

• Gjennomgang av midlertidig sykehistorie og bruk av samtidige medisiner;
• Hvis symptomer er tilstede, utfør en symptomrettet fysisk undersøkelse;
• Vurder lokal og systemisk reaktogenisitet så vel som andre uønskede hendelser;
• Ta blod- og urinprøver for alle tester som angitt i prosedyreoversikten (vedlegg A).
• For frivillige som har samtykket til å gjennomgå hudpunchbiopsier, vil en ekstra hudpunchbiopsi bli utført 1 dag etter administrering av studiemedikamentet på injeksjonsstedet. Det valgte hudstedet for biopsi vil bli renset med povidon-jod og bedøvet ved injeksjon av 1-2 % xylokain. L.M.X.4 (Lidocaine 4%) en lokal anestesikrem kan også påføres. Én slagbiopsi av huden (6 mm) vil bli fjernet. Såret skal sys og steril bandasje påføres. Denne prosedyren etterlater et lite og permanent arr.

Post-Drug Administration besøk

Frivillige vil bli bedt om å returnere til klinikken 2, 3 og 7 dager etter administrering av studiemedisin. På disse dagene vil følgende bli gjennomført:

• Gjennomgang av midlertidig sykehistorie og bruk av samtidige medisiner;
• Hvis symptomer er tilstede, utfør en symptomrettet fysisk undersøkelse;
• Vurder lokal og systemisk reaktogenisitet så vel som andre uønskede hendelser;
• Samle blod- og urinprøver for alle tester som angitt i prosedyreoversikten (vedlegg A);

Oppfølgingsbesøk

I uke 2 vil frivillige bli bedt om å returnere til klinikken for en ytterligere vurdering av sikkerhet og immunogenisitet. Følgende vil bli gjennomført på dette besøket:

• Gjennomgang av midlertidig sykehistorie og bruk av samtidige medisiner;
• Hvis symptomer er tilstede, utfør en symptomrettet fysisk undersøkelse;
• Vurder eventuelle uønskede hendelser;
• Samle blod- og urinprøver for alle tester som angitt i prosedyreoversikten (vedlegg A);
• Suturfjerning etter valgfrie hudbiopsier, hvis biopsier utføres.

Prøver vil ikke bli sendt til vår samarbeidspartner, Dr. Rafick Sekaly, før hans IRB-godkjenning er akseptert og gjennomgått av Rockefellers IRB.