Acido poliinosinico-policitidilico-poli-L-lisina Carbossimetilcellulosa (Poly-ICLC) in volontari sani

Questo protocollo adotterà un approccio di biologia dei sistemi per comprendere negli esseri umani una nuova importante area della biologia dei vaccini: il meccanismo mediante il quale gli adiuvanti, agendo su recettori di riconoscimento di schemi definiti [PRR], migliorano l'immunità delle cellule T e B. Il nostro obiettivo è l'RNA sintetico a doppio filamento, o poli IC e la sua forma più resistente all'RNasi, chiamata poli ICLC, che è disponibile per studi sull'uomo. I PRR sono l'elicasi citosolica, MDA-5, e il recettore endosomiale a pedaggio, TLR3. Il laboratorio Steinman ha sperimentato nei topi e nelle scimmie che il dsRNA è un adiuvante superiore per l'immunità mediata dalle cellule T rispetto a diversi agonisti PRR (Longhi et al., 2009; Stahl-Hennig et al., 2009). Un meccanismo importante è che il poli IC è un induttore superiore dell'interferone sistemico di tipo I [IFN], che a sua volta agisce sui recettori dell'IFN di tipo I [IFNAR] per far maturare la funzione di stimolazione immunitaria delle cellule dendritiche [DC]. Viene indotta una risposta adattativa delle cellule T di tipo Th1, ma è indipendente da IL-12 e IFN-g.

Gli approcci multiparametrici ora forniscono i mezzi per comprendere l'azione adiuvante. Ipotizziamo che le DC subiscano cambiamenti specifici dell'adiuvante e quindi colleghino l'innato a forme selezionate di immunità adattativa. Gli array trascrizionali di DC splenici nei topi mostrano che il dsRNA induce una risposta massiccia con ~ 1000 geni DC splenici che cambiano> 2 volte in 4 ore. Questi cambiamenti sono guidati principalmente dall'IFN di tipo I, prodotto sistemicamente tramite MDA-5 in cellule non derivate dal midollo osseo e quindi agendo su DC IFNAR. IFNAR media la maggior parte dei cambiamenti chiamati "maturazione DC" e acquisizione di attività immunostimolante, ad esempio, CD86, CD40, IL-15 elevati e meccanismi per ripristinare l'omeostasi. In altre parole, IFN piuttosto che PRR di per sé, rappresenta la maggior parte della risposta poli IC nei DC.

In uno studio di fase I recentemente completato (protocollo MAC-682), il poli ICLC è risultato sicuro e ben tollerato quando somministrato come dose singola di 1,6 mg per via sottocutanea (s.c.) e intranasale (i.n.) a volontari sani. I dati preliminari sulla risposta immunitaria innata mostrano, analogamente agli studi preclinici sui topi, una marcata sovraregolazione dell'espressione genica in PBMC intere dopo l'iniezione s.c di poli ICLC. Al giorno 1 dopo l'iniezione di poli ICLC, oltre 2.000 geni sono sovraregolati (cambiamento di espressione > 1,3 volte al giorno 1 rispetto al basale) e queste risposte sono specifiche per il farmaco in studio. È importante sottolineare che i cambiamenti genetici sono omogenei tra gli 8 volontari che hanno ricevuto poli ICLC. I geni sovraregolati in alto sono geni stimolati dall'interferone come sarebbe previsto poiché è noto che il poli ICLC induce interferoni di tipo I. Inoltre, anche i geni associati all'attivazione delle cellule dendritiche (DC) come CD40 e CD86 sono sovraregolati al giorno 1 dopo l'iniezione di poli ICLC, così come i geni coinvolti nelle vie di segnalazione come IRF 5, IRF 7 e STAT1. Poly ICLC ha indotto la secrezione di piccole quantità di interferoni di tipo I e II nel plasma e questi livelli hanno raggiunto il picco al giorno 2 dopo l'iniezione. Infine, l'analisi FACS delle PBMC ha dimostrato che il poli ICLC ha indotto la sovraregolazione dei marcatori di attivazione su diversi sottoinsiemi di cellule dendritiche del sangue. La valutazione dei punti temporali successivi è attualmente in corso, ma le analisi dei campioni del giorno 7 mostrano che i geni coinvolti nella generazione delle risposte delle cellule T e B sono sovraregolati e che i primi geni stimolati dall'interferone stanno scendendo ai livelli di espressione basale. Questi risultati finora mostrano che l'iniezione sottocutanea di poli ICLC ha portato a risposte immunitarie innate sistemiche, dominate dall'induzione di interferoni di tipo I. I test sono stati eseguiti su intere PBMC, tuttavia restano da definire i modelli di espressione genetica di diversi sottoinsiemi di leucociti del sangue in risposta a poli ICLC. Proponiamo ora di estendere l'analisi delle risposte immunitarie sistemiche dopo poli ICLC alla caratterizzazione dei suoi effetti trascrizionali su specifici tipi di cellule del sangue classificate FACS, come DC, monociti, cellule NK e cellule T e B. Analizzando i singoli sottoinsiemi di cellule ci aspettiamo di analizzare meglio il modo in cui il poli ICLC modula le risposte immunitarie innate che possono a loro volta influenzare le risposte immunitarie adattative se somministrate in combinazione con un antigene.

La regolazione significativa dei geni dell'interferone (sia IFN di tipo I che IFN-gamma) non era evidente dall'analisi dell'array genico di intere PBMC, nonostante la misurazione di piccole quantità sia di IFN-alfa che di IFN-gamma nel plasma. Potrebbe essere che la piattaforma utilizzata non fosse abbastanza sensibile per rilevare la regolazione dei geni IFN e intendiamo eseguire RT-PCR per verificare questi risultati. Tuttavia, può darsi che quando limitiamo la nostra analisi al sangue periferico, perdiamo i primi eventi che si verificano dopo la somministrazione di poli ICLC. Per capire come il poli ICLC attiva diverse popolazioni cellulari, è importante caratterizzare i suoi effetti immunoregolatori sia a livello locale che sistemico.

L'ambiente immunitario cutaneo è particolarmente suscettibile alla modulazione del ligando PRR, come evidenziato da imiquimod, che agisce sul TLR 7. In effetti, è stato documentato l'uso di imiquimod per stimolare le risposte immunitarie sia contro gli agenti infettivi (HPV) sia contro i tumori maligni (carcinoma a cellule squamose e basocellulari) . È stato dimostrato che le DC migratorie, che transitano dalla pelle al LN drenante dalla pelle, incrociano le prime risposte immunitarie agli antigeni self e virali. Pertanto, è possibile che le DC cutanee possano migrare in LN o sangue drenanti dalla pelle dopo la somministrazione di poli ICLC. Tuttavia, l'analisi delle sole popolazioni di sangue probabilmente mancherà la finestra dell'alterazione immunitaria se questi eventi si verificano localmente nella pelle. L'analisi dell'espressione genetica e degli infiltrati cellulari nel sito di iniezione di poli ICLC, sia all'inizio (a 6 ore) sia quando l'infiltrazione cutanea è evidente clinicamente (al giorno 1), probabilmente aggiungerà alla nostra comprensione dei suoi effetti adiuvanti. I profili di espressione genomica dei campioni di pelle sono stati utilizzati con successo per la classificazione delle malattie e per prevedere la risposta al trattamento in malattie della pelle come la psoriasi e il carcinoma a cellule squamose (Zaba L et al., 2007; Suarez-Farinas et al., 2010). L'analisi del profilo di espressione genomica nella pelle dopo il poli ICLC può rivelarsi utile per capire come le risposte immunitarie innate vengono avviate dai ligandi dei PRR e forse da altri coadiuvanti del vaccino.

La maggior parte degli studi sul poli ICLC nell'uomo ha utilizzato la via di somministrazione intramuscolare. La somministrazione sottocutanea di poli ICLC non è stata studiata in modo approfondito e il protocollo MAC-682 è stato il primo studio a utilizzare questa via di somministrazione in volontari sani. A seguito di poli ICLC s.c. iniezione, 8 volontari su 8 hanno sviluppato un'area ben definita di eritema, con un certo grado di indurimento e dolorabilità. Questa reazione nel sito di iniezione di solito raggiunge il picco al giorno 2 e si risolve completamente entro il giorno 7. I dati istologici che caratterizzano questo infiltrato non sono disponibili nell'uomo. Tuttavia, i dati sono disponibili nei primati non umani.

Uno studio tossicologico conforme alla BPL è stato condotto su macachi cynomolgus per studiare la sicurezza dell'anti-DEC-205 (3G9) - HIV gag p24 (DCVax-001) in combinazione con l'adiuvante Hiltonol (poli ICLC) per via sottocutanea. In questo studio, ai macachi è stato somministrato un totale di quattro dosi di 10 mg di anticorpo anti-DEC-205-HIV gag p24 in combinazione con 2 mg di poli ICLC, 10 mg di poli ICLC da solo o placebo, per 8 settimane. Per quanto riguarda la reattogenicità (punteggio di Draize modificato), vi erano prove che indicavano che il poli ICLC (10 mg) induceva una reazione al sito di iniezione molto lieve e transitoria sotto forma di eritema; tuttavia, la reazione era ridotta o assente con somministrazioni ripetute, indicando che aveva un significato tossicologico minimo. Nel sito di somministrazione più recente prima dell'eutanasia, 1 giorno dopo l'iniezione di poliICLC, erano presenti numerose lesioni macroscopiche tra cui area scura, scolorimento scuro o materiale gelatinoso. Almeno uno di questi risultati si è verificato in tutti gli animali di entrambi i sessi trattati con 10 mg di poli-ICLC. Microscopicamente, questi erano associati a emorragia e/o presenza di materiale estraneo extracellulare o intracellulare (all'interno dei macrofagi) che si presume rappresentasse prevalentemente l'adiuvante/articolo di prova. Le lesioni sono state quindi considerate coerenti con una prevista reazione locale a materiale estraneo nei siti di iniezione. Dopo il recupero (4 settimane dopo l'iniezione), non sono stati osservati risultati macroscopici correlati alla somministrazione di poli-ICLC. Nonostante le differenze tra la pelle dei primati non umani e la pelle umana, ci aspettiamo di trovare un'infiltrazione cellulare transitoria simile nel sito di poli ICLC s.c. iniezione.

Oltre al suo ruolo nell'antitumorale e nell'immunità virale sopra menzionata, l'imiquimod topico è stato utilizzato come adiuvante in combinazione con la proteina NY-ESO-1 intradermica nei pazienti con melanoma. Questa combinazione ha indotto infiltrati dermici di cellule mononucleate in tutti i pazienti. Gli infiltrati erano composti principalmente da cellule T, monociti, macrofagi, DC mieloidi, cellule NK e, in misura minore, DC plasmacitoidi (Adams et al., 2008). Poly ICLC tuttavia agisce su diversi PRR, MDA-5 e TLR-3 e probabilmente induce la secrezione di IFN di tipo I a livello locale. È probabile che gli effetti immunomodulatori in situ di poli ICLC differiscano dagli effetti di imiquimod. La combinazione della valutazione immunoistochimica degli infiltrati cellulari indotti dal poli ICLC insieme all'analisi dell'array genico dei suoi effetti trascrizionali su tutta la pelle dal sito di iniezione può aiutare a chiarire gli eventi e i meccanismi locali in base ai quali il poli ICLC esercita un effetto adiuvante.

Lavorando con il nostro collaboratore, Rafick Sekaly, che ha utilizzato la biologia dei sistemi per monitorare le risposte innate e adattative al vaccino contro la febbre gialla e ad altre coorti di pazienti (Gaucher et al., 2008), possiamo comprendere la perturbazione adiuvante della funzione immunitaria. I campioni di sangue e pelle raccolti dai volontari dello studio saranno inviati al laboratorio del Dr. Sekaly presso il Vaccine and Gene Therapy Institute, dove verranno eseguiti array trascrizionali e analisi bioinformatiche di alto ordine per ottenere una comprensione globale delle risposte immunitarie innate al poli ICLC.

Lo studio proposto è uno studio in aperto per valutare le risposte immunitarie innate indotte da poli ICLC in volontari sani. Gli obiettivi dello studio sono caratterizzare i cambiamenti trascrizionali indotti dalla somministrazione sottocutanea di poli ICLC su diversi tipi di cellule del sangue e caratterizzare gli infiltrati cellulari e i cambiamenti trascrizionali nel sito di iniezione di poli ICLC.

Ipotesi primaria La somministrazione di poli ICLC a volontari sani indurrà distinti cambiamenti trascrizionali in diversi tipi di cellule del sangue, inclusi diversi sottoinsiemi di DC.

Ipotesi secondaria La somministrazione di poli ICLC a volontari sani indurrà cambiamenti trascrizionali distinti e l'infiltrazione di cellule T e cellule mieloidi nella pelle nel sito di iniezione.

Obiettivo primario:

Valutare le risposte immunitarie innate al poli ICLC in diversi tipi di cellule del sangue, inclusi tre sottoinsiemi di cellule dendritiche dopo somministrazione sottocutanea a volontari sani.

Obiettivi secondari:

• Per valutare le risposte immunitarie innate al poli ICLC nel sito di iniezione.
• Valutare la riproducibilità delle risposte immunitarie innate in PBMC interi dopo una seconda dose di poli ICLC, in volontari che hanno partecipato al protocollo MAC-682 e ora tornano a partecipare a questo studio proposto.

Risultati primari:

• Array trascrizionali in PBMC intere e in 8 sottoinsiemi di leucociti del sangue (naïve e memory T, NK, B, monociti e tre diversi sottoinsiemi di cellule dendritiche (DC plasmacitoidi BDCA1+, BDCA3+ e BDCA2+) dopo s.c. somministrazione di poli ICLC.
• Analisi citofluorimetrica dei marcatori di attivazione in diversi sottoinsiemi di leucociti del sangue.
• Dosaggio delle citochine nel siero e/o plasma dopo s.c. somministrazione di poli ICLC.

Risultati secondari:

• Istologia e immunoistochimica di routine per valutare gli infiltrati cellulari dopo l'iniezione sottocutanea di poli ICLC.
• Analisi trascrizionale di campioni di pelle dal sito di iniezione del farmaco in studio e da un sito non lesionale della pelle.
• Analisi trascrizionale di interi campioni di PBMC in diversi punti temporali dopo la prima dose e la seconda dose di poli ICLC in volontari che hanno partecipato al protocollo MAC-682 e stanno ora tornando per partecipare a questo studio proposto.

Metodi e procedure:

Questionario di pre-screening I potenziali partecipanti saranno prima sottoposti a pre-screening per telefono per valutare l'anamnesi e la qualificazione per lo studio (Appendice C - Questionario di pre-screening). I potenziali volontari avranno l'opportunità di discutere lo studio e porre domande al reclutatore dello studio in questo momento. Coloro che sono idonei e interessati a partecipare parteciperanno a una visita di screening presso la clinica ambulatoriale del Rockefeller Hospital.

Visita di selezione

Durante la visita di screening, il personale dello studio risponderà a qualsiasi domanda sullo studio. Il consenso informato scritto sarà ottenuto prima di condurre qualsiasi procedura di studio. Per garantire il consenso informato, il ricercatore principale o il designato discuteranno individualmente con ciascun volontario i seguenti processi e spiegazioni:

1. Consulenza pre-test HIV.
2. I volontari sessualmente attivi devono utilizzare una forma affidabile di contraccezione dallo screening fino a 6 settimane dopo la somministrazione del farmaco.

Se il volontario acconsente a partecipare, il personale del sito:

• Eseguire l'anamnesi completa (compresi i farmaci concomitanti);
• Eseguire un esame fisico generale che includa altezza, peso, segni vitali (polso, frequenza respiratoria, pressione sanguigna e temperatura), esame della pelle, dei sistemi respiratorio, cardiovascolare e addominale e una valutazione dei linfonodi cervicali e ascellari;
• Raccogliere campioni di sangue e urina per tutti i test come indicato nel Programma delle procedure (Appendice A);
• Eseguire un test di gravidanza per tutte le donne volontarie.

I test di laboratorio di screening possono essere ripetuti a discrezione del ricercatore principale o designato per indagare su eventuali anomalie isolate.

Se la visita di screening avviene più di 45 giorni prima della data di somministrazione del farmaco, le procedure dello studio per la visita di screening devono essere ripetute. Tuttavia, l'anamnesi completa può essere sostituita da un'anamnesi intermedia e il modulo di consenso informato può essere rivisto senza firmare nuovamente.

Visita di amministrazione del farmaco (giorno 0)

Prima della somministrazione del farmaco in studio, il personale del sito:

• Rispondere a qualsiasi domanda sullo studio;
• Rivedere la storia medica provvisoria (compresi i farmaci concomitanti);
• Esaminare i dati di laboratorio sulla sicurezza;
• Rivedere il modulo di consenso informato somministrato alla visita di screening con il volontario;
• Eseguire un esame fisico diretto compresi i segni vitali (polso, frequenza respiratoria, pressione sanguigna e temperatura), nonché una valutazione dei linfonodi ascellari e qualsiasi ulteriore esame indicato dall'anamnesi o dall'osservazione;
• Raccogliere campioni di sangue e urina per tutti i test come indicato nel Programma delle procedure (Appendice A);
• Eseguire un test di gravidanza per tutte le donne volontarie (il sangue verrà inviato stat) e ottenere i risultati prima della somministrazione del farmaco
• Eseguire la valutazione di base del sito del farmaco in studio e valutare e registrare eventuali sintomi sistemici;
• Somministrare il farmaco in studio (i siti di iniezione possono essere la parte superiore delle braccia, le cosce o i glutei)
• Per i volontari che hanno accettato di sottoporsi a biopsie con punch cutaneo, verranno eseguite due biopsie con punch cutaneo: uno in un sito cutaneo controlaterale al sito di iniezione e l'altro nel sito di iniezione, 6 ore dopo la somministrazione del farmaco oggetto dello studio. I due siti cutanei selezionati per la biopsia saranno puliti con iodio-povidone e anestetizzati mediante iniezione di 1-2% di xilocaina. L.M.X.4 (lidocaina 4%) può essere applicata anche una crema anestetica topica. Verranno rimosse due punch biopsie della pelle (6 mm). Le ferite verranno suturate e verrà applicata una medicazione sterile. Questa procedura lascia una cicatrice piccola e permanente.
• Il volontario avrà la possibilità di rimanere in ospedale durante la notte la notte prima della somministrazione del farmaco in studio o del placebo e/o il giorno della somministrazione del farmaco in studio per comodità ("pensionanti") o essere programmato come paziente diurno

I volontari saranno strettamente osservati per almeno 30 - 45 minuti dopo la somministrazione del farmaco. I segni vitali (polso, frequenza respiratoria, pressione sanguigna e temperatura) saranno monitorati 30-45 minuti dopo la vaccinazione e registrati. Qualsiasi evento di reattogenicità locale e sistemica, così come qualsiasi altro evento che si verifica, verrà registrato a 30 - 45 minuti. Ai volontari verrà consegnata una scheda del diario (Appendice B) e verrà chiesto di registrare eventuali eventi di reattogenicità che si verificano nel primo giorno dopo la somministrazione del farmaco e tra i giorni 1 e 3 e tra i giorni 3 e 7. Il personale del sito spiegherà al volontario come registrare la reattogenicità eventi.

Sarà eseguita una fotografia medica per documentare il sito di iniezione e le modifiche successive all'iniezione, se presenti. L'identità del volontario sarà mantenuta riservata.

Giorno 1 Visita post-somministrazione del farmaco

• Revisione della storia medica provvisoria e uso di farmaci concomitanti;
• Se i sintomi sono presenti, eseguire un esame obiettivo mirato;
• Valutare la reattogenicità locale e sistemica nonché qualsiasi altro evento avverso;
• Raccogliere campioni di sangue e urina per tutti i test come indicato nel Programma delle procedure (Appendice A).
• Per i volontari che hanno accettato di sottoporsi a biopsie con punch cutaneo, verrà eseguita un'ulteriore biopsia con punch cutaneo 1 giorno dopo la somministrazione del farmaco in studio, nel sito di iniezione. Il sito cutaneo selezionato per la biopsia sarà pulito con iodio-povidone e anestetizzato mediante iniezione di 1-2% di xilocaina. L.M.X.4 (lidocaina 4%) può essere applicata anche una crema anestetica topica. Verrà rimossa una biopsia della pelle (6 mm). La ferita verrà suturata e verrà applicata una medicazione sterile. Questa procedura lascia una cicatrice piccola e permanente.

Visite post somministrazione del farmaco

Ai volontari verrà chiesto di tornare alla clinica 2, 3 e 7 giorni dopo la somministrazione del farmaco in studio. In quei giorni si svolgeranno:

• Revisione della storia medica provvisoria e uso di farmaci concomitanti;
• Se i sintomi sono presenti, eseguire un esame obiettivo mirato;
• Valutare la reattogenicità locale e sistemica nonché qualsiasi altro evento avverso;
• Raccogliere campioni di sangue e urina per tutti i test come indicato nel Programma delle procedure (Appendice A);

Visita di follow-up

Alla settimana 2, ai volontari verrà chiesto di tornare in clinica per un'ulteriore valutazione della sicurezza e dell'immunogenicità. Durante questa visita verranno effettuati:

• Revisione della storia medica provvisoria e uso di farmaci concomitanti;
• Se i sintomi sono presenti, eseguire un esame obiettivo mirato;
• Valutare eventuali eventi avversi;
• Raccogliere campioni di sangue e urina per tutti i test come indicato nel Programma delle procedure (Appendice A);
• Rimozione della sutura dopo biopsie cutanee facoltative, se vengono eseguite biopsie.

I campioni non verranno spediti al nostro collaboratore, il Dr. Rafick Sekaly fino a quando la sua approvazione IRB non sarà accettata e rivista dall'IRB di Rockefeller.