Ácido poliinosínico-policitidílico-poli-L-lisina Carboximetilcelulose (Poli-ICLC) em voluntários saudáveis

Este protocolo terá uma abordagem de biologia de sistemas para entender em humanos uma nova área importante da biologia de vacinas: o mecanismo pelo qual os adjuvantes, atuando em receptores de reconhecimento de padrão definido [PRR], aumentam a imunidade das células T e B. Nosso foco é o RNA sintético de fita dupla, ou poli IC e sua forma mais resistente à RNase, denominada poli ICLC, que está disponível para estudos em humanos. Os PRRs são a helicase citosólica, MDA-5, e o receptor semelhante ao endossomal, TLR3. O laboratório Steinman foi pioneiro em camundongos e macacos que o dsRNA é um adjuvante superior para a imunidade mediada por células T em relação a vários agonistas PRR (Longhi et al., 2009; Stahl-Hennig et al., 2009). Um mecanismo importante é que o poli IC é um indutor superior do interferon tipo I sistêmico [IFN], que por sua vez atua nos receptores IFN tipo I [IFNAR] para amadurecer a função imunoestimulatória das células dendríticas [DCs]. Uma resposta adaptativa de células T do tipo Th1 é induzida, mas é independente de IL-12 e IFN-g.

Abordagens multiparâmetros agora fornecem os meios para entender a ação adjuvante. Nossa hipótese é que as DCs sofrem alterações que são específicas do adjuvante e, em seguida, ligam formas inatas para selecionar formas de imunidade adaptativa. Matrizes de transcrição de DCs esplênicas em camundongos mostram que o dsRNA induz uma resposta massiva com ~ 1000 genes DC esplênicos mudando > 2 vezes em 4 horas. Essas alterações são conduzidas principalmente via IFN tipo I, produzido sistemicamente via MDA-5 em células não derivadas da medula óssea e, em seguida, atuando no DC IFNAR. Os IFNAR medeiam a maioria das alterações denominadas "maturação de DC" e aquisição de atividade imunoestimulante, por exemplo, CD86, CD40, IL-15 elevados e mecanismos para restaurar a homeostase. Em outras palavras, o IFN, em vez do PRR per se, é responsável pela maior parte da resposta poli IC nas DCs.

Em um estudo de fase I recentemente concluído (protocolo MAC-682), o poliICLC demonstrou ser seguro e bem tolerado quando administrado em dose única de 1,6 mg por via subcutânea (s.c.) e intranasal (i.n.) a voluntários saudáveis. Os dados preliminares da resposta imune inata mostram, de forma semelhante aos estudos pré-clínicos em camundongos, regulação positiva acentuada da expressão gênica em PBMCs inteiros após injeção s.c. de poli ICLC. No dia 1 após a injeção de poli ICLC, mais de 2.000 genes são regulados positivamente (> 1,3 vezes a alteração da expressão no dia 1 versus na linha de base) e essas respostas são específicas para a droga do estudo. É importante ressaltar que as alterações genéticas são homogêneas entre os 8 voluntários que receberam poli ICLC. Os genes superregulados são genes estimulados por interferon, como seria de prever, uma vez que o poli ICLC é conhecido por induzir interferons tipo I. Além disso, genes associados à ativação de células dendríticas (DC), como CD40 e CD86, também são regulados positivamente no dia 1 após a injeção de poli ICLC, bem como genes envolvidos em vias de sinalização, como IRF 5, IRF 7 e STAT1. Poli ICLC induziu a secreção de pequenas quantidades de interferons tipo I e II no plasma e esses níveis atingiram o pico no dia 2 após a injeção. Por fim, a análise FACS de PBMCs demonstrou que o poli ICLC induziu a regulação positiva de marcadores de ativação em diferentes subconjuntos de células dendríticas sanguíneas. A avaliação de pontos de tempo posteriores está ocorrendo atualmente, mas as análises de amostras do dia 7 mostram que os genes envolvidos na geração de respostas de células T e B são regulados positivamente e os primeiros genes estimulados por interferon estão tendendo a níveis basais de expressão. Esses resultados até agora mostram que a injeção subcutânea de poli ICLC levou a respostas imunes inatas sistêmicas, dominadas pela indução de interferons tipo I. Os ensaios foram realizados em PBMCs inteiros, no entanto, os padrões de expressão genética de diferentes subconjuntos de leucócitos sanguíneos em resposta a poli ICLC ainda precisam ser definidos. Propomos agora estender a análise de respostas imunes sistêmicas após poli ICLC para a caracterização de seus efeitos transcricionais em tipos específicos de células sanguíneas classificadas por FACS, como DCs, monócitos, células NK, bem como células T e B. Ao analisar subconjuntos de células individuais, esperamos dissecar melhor como o poli ICLC modula as respostas imunes inatas que, por sua vez, podem afetar as respostas imunes adaptativas quando administradas em combinação com um antígeno.

A regulação significativa dos genes do interferon (ambos os IFNs tipo I e IFN-gama) não foi evidente pela análise de matriz de genes de PBMCs inteiros, apesar da medição de pequenas quantidades de IFN-alfa e IFN-gama no plasma. Pode ser que a plataforma utilizada não tenha sido sensível o suficiente para detectar a regulação dos genes IFN e planejamos realizar RT-PCR para verificar esses achados. No entanto, pode ser que, quando restringimos nossa análise ao sangue periférico, percamos os eventos iniciais que ocorrem após a administração de poliICLC. Para entender como o poli ICLC ativa diferentes populações de células, é importante caracterizar seus efeitos imunorreguladores tanto local quanto sistemicamente.

O ambiente imunológico cutâneo é particularmente receptivo à modulação do ligante PRR, conforme evidenciado pelo imiquimod, que atua no TLR 7. De fato, o uso de imiquimod para estimular respostas imunes contra agentes infecciosos (HPV) e malignidade (carcinoma escamoso e basocelular) foi documentado . DCs migratórias, que trafegam da pele para a pele drenando LN, mostraram cruzar respostas imunes primárias para antígenos próprios e virais. Como tal, é possível que as DCs da pele possam migrar para os LNs que drenam a pele ou para o sangue após a administração de poli ICLC. No entanto, a análise apenas das populações de sangue provavelmente perderá a janela de alteração imune se esses eventos estiverem ocorrendo localmente na pele. A análise da expressão genética e dos infiltrados celulares no local da injeção de poliICLC, tanto no início (às 6 horas) quanto quando a infiltração na pele é clinicamente evidente (no dia 1), provavelmente aumentará nossa compreensão de seus efeitos adjuvantes. Perfis de expressão genômica de amostras de pele têm sido usados ​​com sucesso para classificação de doenças e para prever a resposta ao tratamento em doenças de pele como psoríase e carcinoma de células escamosas (Zaba L et al., 2007; Suarez-Farinas et al., 2010). A análise do perfil de expressão genômica na pele após poli ICLC pode ser útil para entender como as respostas imunes inatas são iniciadas por ligantes de PRRs e talvez por outros adjuvantes de vacinas.

A maioria dos estudos de poli ICLC em humanos utilizou a via de administração intramuscular. A administração subcutânea de poli ICLC não foi estudada extensivamente e o protocolo MAC-682 foi o primeiro estudo a utilizar esta via de administração em voluntários saudáveis. Seguindo poli ICLC s.c. injeção, 8 de 8 voluntários desenvolveram uma área bem definida de eritema, com algum grau de endurecimento e sensibilidade. Essa reação no local da injeção geralmente atinge o pico no dia 2 e é completamente resolvida no dia 7. Os dados histológicos que caracterizam esse infiltrado não estão disponíveis em humanos. No entanto, existem dados disponíveis em primatas não humanos.

Um estudo de toxicologia compatível com GLP foi realizado em macacos cynomolgus para investigar a segurança do anti-DEC-205 (3G9) - HIV gag p24 (DCVax-001) em combinação com o adjuvante Hiltonol (poly ICLC) por via subcutânea. Neste estudo, os macacos receberam um total de quatro doses de 10 mg de anticorpo anti-DEC-205-HIV gag p24 em combinação com 2 mg de poli ICLC, 10 mg de poli ICLC sozinho ou placebo, durante 8 semanas. No que diz respeito à reatogenicidade (pontuação de Draize modificada), há evidências que indicam que o poli ICLC (10 mg) induziu uma reação muito leve e transitória no local da injeção na forma de eritema; no entanto, a reação foi reduzida ou ausente com dosagens repetidas, indicando que era de significância toxicológica mínima. Várias lesões macroscópicas, incluindo área escura, descoloração escura ou material gelatinoso estavam presentes no local de administração mais recente antes da eutanásia, 1 dia após a injeção de poli ICLC. Pelo menos um desses achados ocorreu em todos os animais de ambos os sexos que receberam 10 mg de poli-ICLC. Microscopicamente, estes foram associados com hemorragia e/ou presença de material estranho extracelular ou intracelular (dentro de macrófagos) presumivelmente representando predominantemente adjuvante/artigo de teste. As lesões foram, portanto, consideradas consistentes com uma reação local esperada a material estranho nos locais de injeção. Após a recuperação (4 semanas após a injeção), não foram observados achados macroscópicos relacionados à administração de poli-ICLC. Apesar das diferenças entre a pele de primatas não humanos e a pele humana, esperamos encontrar infiltração celular transitória semelhante no local de poli ICLC s.c. injeção.

Além de seu papel na imunidade antitumoral e viral mencionada acima, o imiquimode tópico tem sido usado como adjuvante em combinação com a proteína NY-ESO-1 intradérmica em pacientes com melanoma. Esta combinação induziu infiltrados de células mononucleares dérmicas em todos os pacientes. Os infiltrados eram compostos principalmente por células T, monócitos, macrófagos, DCs mielóides, células NK e, em menor extensão, DCs plasmocitóides (Adams et al., 2008). No entanto, o Poly ICLC atua em diferentes PRRs, MDA-5 e TLR-3, e provavelmente induz a secreção de IFNs tipo I localmente. Os efeitos imunomoduladores in situ do poli ICLC provavelmente diferem dos efeitos do imiquimod. A combinação da avaliação imuno-histoquímica dos infiltrados celulares induzidos por poli ICLC juntamente com a análise de matriz genética de seus efeitos transcricionais em toda a pele a partir do local da injeção pode ajudar a elucidar os eventos e mecanismos locais pelos quais o poli ICLC exerce um efeito adjuvante.

Ao trabalhar com nosso colaborador, Rafick Sekaly, que usou a biologia de sistemas para monitorar as respostas inatas e adaptativas à vacina contra a febre amarela e outras coortes de pacientes (Gaucher et al., 2008), podemos entender a perturbação adjuvante da função imunológica. Amostras de sangue e pele coletadas dos voluntários do estudo serão enviadas ao laboratório do Dr. Sekaly no Vaccine and Gene Therapy Institute, onde matrizes de transcrição e análises de bioinformática de alta ordem serão realizadas para obter uma compreensão global das respostas imunes inatas ao poli ICLC.

O estudo proposto é um estudo aberto para avaliar as respostas imunes inatas poli ICLC induzidas em voluntários saudáveis. Os objetivos do estudo são caracterizar as alterações transcricionais induzidas pela administração subcutânea de poli ICLC em diferentes tipos de células sanguíneas e caracterizar os infiltrados celulares e alterações transcricionais no local da injeção de poli ICLC.

Hipótese Primária A administração de poli ICLC a voluntários saudáveis ​​irá induzir alterações transcricionais distintas em diferentes tipos de células sanguíneas, incluindo diferentes subconjuntos de DCs.

Hipótese Secundária A administração de poli ICLC a voluntários saudáveis ​​induzirá alterações transcricionais distintas e infiltração de células T e células mieloides na pele no local da injeção.

Objetivo primário:

Avaliar as respostas imunes inatas ao poli ICLC em diferentes tipos de células sanguíneas, incluindo três subconjuntos de células dendríticas após administração subcutânea a voluntários saudáveis.

Objetivos Secundários:

• Avaliar as respostas imunes inatas ao poli ICLC no local da injeção.
• Avaliar a reprodutibilidade das respostas imunes inatas em PBMCs inteiros após uma segunda dose de poli ICLC, em voluntários que participaram do protocolo MAC-682 e agora retornam para participar deste estudo proposto.

Resultado(s) Primário(s):

• Arranjos de transcrição em PBMCs inteiros e em 8 subconjuntos de leucócitos sanguíneos (naïve e memória T, NK, B, monócitos e três subconjuntos diferentes de células dendríticas (BDCA1+, BDCA3+ e BDCA2+ DCs plasmocitóides) após s.c. administração de poli ICLC.
• Análise por citometria de fluxo de marcadores de ativação em diferentes subconjuntos de leucócitos sanguíneos.
• Medição de citocinas no soro e/ou plasma após injeção s.c. administração de poli ICLC.

Resultado(s) Secundário(s):

• Histologia de rotina e imuno-histoquímica para avaliar infiltrados celulares após injeção subcutânea de poli ICLC.
• Análise de transcrição de amostras de pele do local de injeção do medicamento do estudo e de um local não lesivo da pele.
• Análise transcricional de amostras inteiras de PBMC em diferentes momentos após a primeira dose e a segunda dose de poli ICLC em voluntários que participaram do protocolo MAC-682 e agora estão retornando para participar deste estudo proposto.

Métodos e Procedimentos:

Questionário de pré-triagem Os participantes em potencial passarão primeiro por uma pré-triagem por telefone para avaliar o histórico médico e a qualificação para o estudo (Apêndice C - Questionário de pré-triagem). Os potenciais voluntários terão a oportunidade de discutir o estudo e fazer perguntas ao recrutador do estudo neste momento. Aqueles que são elegíveis e interessados ​​em participar participarão de uma consulta de triagem no Ambulatório do Hospital Rockefeller.

Visita de Triagem

Durante a visita de triagem, a equipe do estudo responderá a quaisquer perguntas sobre o estudo. O consentimento informado por escrito será obtido antes da realização de qualquer procedimento do estudo. Para garantir o consentimento informado, o investigador principal ou pessoa designada discutirá os seguintes processos e explicações individualmente com cada voluntário:

1. Aconselhamento pré-teste de HIV.
2. Voluntárias sexualmente ativas devem usar uma forma confiável de contracepção desde a triagem até 6 semanas após a administração do medicamento.

Se o voluntário consentir em participar, o pessoal do local irá:

• Realizar histórico médico completo (incluindo medicação concomitante);
• Realizar um exame físico geral, incluindo altura, peso, sinais vitais (pulso, frequência respiratória, pressão arterial e temperatura), exame da pele, sistemas respiratório, cardiovascular e abdominal e uma avaliação dos gânglios linfáticos cervicais e axilares;
• Colete amostras de sangue e urina para todos os testes conforme indicado no Cronograma de Procedimentos (Apêndice A);
• Realize um teste de gravidez para todas as voluntárias.

Os testes laboratoriais de triagem podem ser repetidos a critério do investigador principal ou pessoa designada para investigar quaisquer anormalidades isoladas.

Se a visita de triagem ocorrer mais de 45 dias antes da data de administração do medicamento, os procedimentos do estudo para a visita de triagem devem ser repetidos. No entanto, o histórico médico completo pode ser substituído por um histórico médico provisório e o formulário de consentimento informado pode ser revisado sem assinar novamente.

Visita de Administração de Medicamentos (Dia 0)

Antes da administração do medicamento do estudo, o pessoal do centro irá:

• Responder a quaisquer perguntas sobre o estudo;
• Revise o histórico médico intermediário (incluindo medicamentos concomitantes);
• Revisar dados laboratoriais de segurança;
• Revise o formulário de consentimento informado administrado na visita de triagem com o voluntário;
• Realize um exame físico direcionado, incluindo sinais vitais (pulso, frequência respiratória, pressão arterial e temperatura), bem como uma avaliação dos gânglios linfáticos axilares e qualquer exame adicional indicado pela história ou observação;
• Colete amostras de sangue e urina para todos os testes conforme indicado no Cronograma de Procedimentos (Apêndice A);
• Realize um teste de gravidez para todas as voluntárias (o sangue será enviado imediatamente) e obtenha os resultados antes da administração do medicamento
• Realize avaliação inicial do local do medicamento em estudo e avalie e registre quaisquer sintomas sistêmicos;
• Administrar o medicamento do estudo (os locais de injeção podem ser braços, coxas ou nádegas)
• Para voluntários que concordaram em se submeter a biópsias de punção de pele, duas biópsias de punção de pele serão realizadas: uma em um local de pele contralateral ao local de injeção e outra no local de injeção, 6 horas após a administração do medicamento do estudo. Os dois locais de pele selecionados para biópsia serão limpos com iodopovidona e anestesiados por injeção de 1-2% de xilocaína. L.M.X.4 (Lidocaína 4%) também pode ser aplicado um creme anestésico tópico. Duas biópsias de pele (6 mm) serão removidas. As feridas serão suturadas e curativos estéreis aplicados. Este procedimento deixa uma cicatriz pequena e permanente.
• O voluntário terá a opção de passar a noite no hospital na noite anterior à administração do medicamento ou placebo do estudo e/ou no dia da administração do medicamento do estudo por conveniência ("internos") ou ser agendado como paciente diurno

Os voluntários serão observados de perto por pelo menos 30 a 45 minutos após a administração do medicamento. Os sinais vitais (pulso, frequência respiratória, pressão arterial e temperatura) serão monitorados 30 a 45 minutos após a vacinação e registrados. Quaisquer eventos de reatogenicidade local e sistêmica, bem como qualquer outro evento que ocorra, serão registrados em 30 - 45 minutos. Os voluntários receberão um cartão diário (Apêndice B) e serão solicitados a registrar quaisquer eventos de reatogenicidade que ocorram no primeiro dia após a administração do medicamento e entre os dias 1 e 3 e entre os dias 3 e 7. A equipe do local explicará ao voluntário como registrar a reatogenicidade eventos.

Serão feitas fotografias médicas para documentar o local da injeção e as alterações após a injeção, se houver. A identidade do voluntário será mantida em sigilo.

Dia 1 Visita Pós-Administração de Medicamentos

• Revisão da história médica interina e uso de medicamentos concomitantes;
• Se os sintomas estiverem presentes, faça um exame físico direcionado aos sintomas;
• Avaliar a reatogenicidade local e sistêmica, bem como quaisquer outros eventos adversos;
• Colete amostras de sangue e urina para todos os testes conforme indicado no Cronograma de Procedimentos (Apêndice A).
• Para os voluntários que concordaram em se submeter a biópsias de punção de pele, uma biópsia de punção de pele adicional será realizada 1 dia após a administração do medicamento do estudo, no local da injeção. O local da pele selecionado para biópsia será limpo com iodopovidona e anestesiado por injeção de 1-2% de xilocaína. L.M.X.4 (Lidocaína 4%) também pode ser aplicado um creme anestésico tópico. Uma biópsia de punção da pele (6 mm) será removida. A ferida será suturada e curativo estéril aplicado. Este procedimento deixa uma cicatriz pequena e permanente.

Visitas pós-administração de medicamentos

Os voluntários serão solicitados a retornar à clínica 2, 3 e 7 dias após a administração do medicamento do estudo. Nesses dias serão realizadas as seguintes atividades:

• Revisão da história médica interina e uso de medicamentos concomitantes;
• Se os sintomas estiverem presentes, faça um exame físico direcionado aos sintomas;
• Avaliar a reatogenicidade local e sistêmica, bem como quaisquer outros eventos adversos;
• Colete amostras de sangue e urina para todos os testes conforme indicado no Cronograma de Procedimentos (Apêndice A);

Visita de acompanhamento

Na semana 2, os voluntários serão solicitados a retornar à clínica para uma avaliação adicional de segurança e imunogenicidade. Nesta visita serão realizados:

• Revisão da história médica interina e uso de medicamentos concomitantes;
• Se os sintomas estiverem presentes, faça um exame físico direcionado aos sintomas;
• Avaliar quaisquer eventos adversos;
• Colete amostras de sangue e urina para todos os testes conforme indicado no Cronograma de Procedimentos (Apêndice A);
• Remoção da sutura após biópsias de pele opcionais, se forem realizadas biópsias.

As amostras não serão enviadas ao nosso colaborador, Dr. Rafick Sekaly, até que sua aprovação do IRB seja aceita e revisada pelo IRB da Rockefeller.