Polyinosin-polycytidylová kyselina-poly-L-lysinkarboxymethylcelulóza (Poly-ICLC) u zdravých dobrovolníků

Tento protokol bude mít přístup systémové biologie, aby u lidí porozuměl nové hlavní oblasti biologie vakcín: mechanismu, kterým adjuvancia, působící na definované receptory rozpoznávající vzory [PRR], zvyšují imunitu T a B buněk. Zaměřujeme se na syntetickou dvouvláknovou RNA nebo poly IC a její formu odolnější vůči RNáze, nazývanou poly ICLC, která je dostupná pro studie na lidech. PRR jsou cytosolická helikáza, MDA-5, a endosomální toll like receptor, TLR3. Steinmanova laboratoř byla průkopníkem u myší a opic, že ​​dsRNA je lepší adjuvans pro imunitu zprostředkovanou T buňkami ve srovnání s několika agonisty PRR (Longhi et al., 2009; Stahl-Hennig et al., 2009). Hlavním mechanizmem je, že poly IC je vynikajícím induktorem systémového interferonu typu I [IFN], který zase působí na receptory IFN typu I [IFNAR], aby vyzrály imunostimulační funkce dendritických buněk [DC]. Je indukována adaptivní reakce T buněk typu Th1, ale je nezávislá na IL-12 a IFN-g.

Víceparametrové přístupy nyní poskytují prostředky k pochopení adjuvantní akce. Předpokládáme, že DC procházejí změnami, které jsou specifické pro adjuvans, a poté spojují vrozené s vybranými formami adaptivní imunity. Transkripční pole slezinných DC u myší ukazují, že dsRNA indukuje masivní odpověď s ~1000 slezinnými DC geny měnícími se >2krát za 4 hodiny. Tyto změny jsou řízeny primárně prostřednictvím IFN typu I, produkovaného systémově prostřednictvím MDA-5 v buňkách nepocházejících z kostní dřeně a poté působením na DC IFNAR. IFNAR zprostředkovává většinu změn nazývaných "zrání DC" a získání imunostimulační aktivity, např. vysoké CD86, CD40, IL-15, a mechanismy pro obnovení homeostázy. Jinými slovy, IFN spíše než PRR per se odpovídá za většinu poly IC odpovědi u DC.

V nedávno dokončené studii fáze I (protokol MAC-682) bylo zjištěno, že poly ICLC je bezpečný a dobře tolerovaný, když je podáván jako jednorázová dávka 1,6 mg subkutánně (s.c.) a intranazálně (i.n.) zdravým dobrovolníkům. Předběžná data vrozené imunitní odpovědi ukazují, podobně jako preklinické studie na myších, výraznou upregulaci genové exprese v celých PBMC po s.c injekci poly ICLC. V den 1 po injekci poly ICLC je upregulováno více než 2 000 genů (> 1,3násobná změna exprese v den 1 oproti výchozí hodnotě) a tyto reakce jsou specifické pro studované léčivo. Důležité je, že genové změny jsou homogenní mezi 8 dobrovolníky, kteří dostali poly ICLC. Horní upregulované geny jsou geny stimulované interferonem, jak by se dalo předpokládat, protože je známo, že poly ICLC indukuje interferony typu I. Navíc geny spojené s aktivací dendritrických buněk (DC), jako je CD40 a CD86, jsou také upregulovány v den 1 po injekci poly ICLC, stejně jako geny zapojené do signálních drah, jako jsou IRF 5, IRF 7 a STAT1. Poly ICLC indukovala sekreci malých množství interferonů typu I a II v plazmě a tyto hladiny dosáhly vrcholu 2. den po injekci. Konečně, FACS analýza PBMC prokázala, že poly ICLC indukuje upregulaci aktivačních markerů na různých podskupinách krevních dendritických buněk. V současné době probíhá hodnocení pozdějších časových bodů, ale analýzy vzorků ze dne 7 ukazují, že geny zapojené do vytváření odpovědí T a B buněk jsou upregulovány a časné geny stimulované interferonem klesají k základním hladinám exprese. Tyto výsledky zatím ukazují, že subkutánní injekce poly ICLC vedla k systémovým vrozeným imunitním odpovědím, kterým dominovala indukce interferonů typu I. Testy byly provedeny v celých PBMC, avšak vzory genetické exprese různých podskupin krevních leukocytů v reakci na poly ICLC zbývá definovat. Nyní navrhujeme rozšířit analýzu systémových imunitních odpovědí po poly ICLC o charakterizaci jejích transkripčních účinků na specifické typy krvinek tříděných FACS, jako jsou DC, monocyty, NK buňky a také T a B buňky. Očekáváme, že analýzou jednotlivých podskupin buněk lépe rozebereme, jak poly ICLC moduluje vrozené imunitní reakce, které mohou zase ovlivnit adaptivní imunitní reakce, když jsou podávány v kombinaci s antigenem.

Významná regulace interferonových genů (jak IFN typu I, tak IFN-gama) nebyla evidentní analýzou genového pole celých PBMC, navzdory měření malých množství jak IFN-alfa, tak IFN-gama v plazmě. Je možné, že použitá platforma nebyla dostatečně citlivá pro detekci regulace genů IFN a plánujeme provést RT-PCR k ověření těchto zjištění. Může se však stát, že když omezíme naši analýzu na periferní krev, vynecháme rané události, ke kterým dochází po podání poly ICLC. Abychom pochopili, jak poly ICLC aktivuje různé buněčné populace, je důležité charakterizovat jeho imunoregulační účinky jak lokálně, tak systémově.

Kožní imunitní prostředí je zvláště přístupné modulaci ligandu PRR, jak dokazuje imichimod, který působí na TLR 7. Bylo skutečně zdokumentováno použití imichimodu ke stimulaci imunitních reakcí proti infekčním agens (HPV) a malignitě (karcinom dlaždicových a bazálních buněk). . Migrující DC, které se pohybují z kůže do kůže a odvádějí LN, prokázaly křížení primárních imunitních odpovědí na vlastní a virové antigeny. Jako takové je možné, že kožní DC mohou migrovat do kožních drenážních LN nebo krve po podání poly ICLC. Samotná analýza krevních populací však pravděpodobně nevynechá okno imunitních změn, pokud se tyto události vyskytují lokálně v kůži. Analýza genetické exprese a buněčných infiltrátů v místě injekce poly ICLC, a to jak brzy (po 6 hodinách), tak i tehdy, když je kožní infiltrace evidentní klinicky (v den 1), pravděpodobně přispěje k našemu chápání jejích adjuvantních účinků. Profily genomové exprese vzorků kůže byly úspěšně použity pro klasifikaci onemocnění a pro predikci odpovědi na léčbu kožních onemocnění, jako je psoriáza a spinocelulární karcinom (Zaba L et al., 2007; Suarez-Farinas et al., 2010). Analýza profilu genomové exprese v kůži po poly ICLC se může ukázat jako užitečná pro pochopení toho, jak jsou vrozené imunitní reakce iniciovány PRR ligandy a možná i jinými adjuvans vakcíny.

Většina studií poly ICLC u lidí používala intramuskulární způsob podání. Subkutánní podávání poly ICLC nebylo rozsáhle studováno a protokol MAC-682 byl první studií, která používala tento způsob podávání u zdravých dobrovolníků. Po poly ICLC s.c. injekci se u 8 z 8 dobrovolníků vyvinula dobře definovaná oblast erytému s určitým stupněm zatvrdnutí a citlivosti. Tato reakce v místě vpichu obvykle vrcholí 2. den a zcela vymizí do 7. dne. Histologická data charakterizující tento infiltrát nejsou u lidí k dispozici. Údaje jsou však dostupné u subhumánních primátů.

U makaků cynomolgus byla provedena toxikologická studie vyhovující GLP, aby se prozkoumala bezpečnost anti-DEC-205 (3G9) - HIV gag p24 (DCVax-001) v kombinaci s adjuvans Hiltonol (poly ICLC) subkutánně. V této studii byly makakům podávány celkem čtyři dávky 10 mg protilátky anti-DEC-205-HIV gag p24 v kombinaci s 2 mg poly ICLC, 10 mg poly ICLC samotného nebo placeba, po dobu 8 týdnů. Pokud jde o reaktogenitu (upravené Draizeho skóre), existují důkazy naznačující, že poly ICLC (10 mg) vyvolalo velmi mírnou a přechodnou reakci v místě vpichu ve formě erytému; reakce však byla snížena nebo chyběla při opakovaném podávání, což naznačuje, že měla minimální toxikologický význam. V posledním místě podání před eutanazií, 1 den po injekci poly ICLC, byla přítomna řada velkých lézí včetně tmavé oblasti, tmavého zbarvení nebo želatinového materiálu. Alespoň jeden z těchto nálezů se vyskytl u všech zvířat obou pohlaví, která dostávala 10 mg poly-ICLC. Mikroskopicky byly spojeny s krvácením a/nebo přítomností extracelulárního nebo intracelulárního (uvnitř makrofágů) cizího materiálu, o kterém se předpokládá, že představuje převážně adjuvans/testovaný předmět. Léze byly proto považovány za konzistentní s očekávanou lokální reakcí na cizí materiál v místech vpichu. Po zotavení (4 týdny po injekci) nebyly zaznamenány žádné makroskopické nálezy související s podáváním poly-ICLC. Navzdory rozdílům mezi kůží nehumánních primátů a lidskou kůží očekáváme, že najdeme podobnou přechodnou buněčnou infiltraci v místě poly ICLC s.c. injekce.

Kromě své role v protinádorové a virové imunitě uvedené výše byl topický imichimod použit jako adjuvans v kombinaci s intradermálním proteinem NY-ESO-1 u pacientů s melanomem. Tato kombinace vyvolala u všech pacientů infiltráty dermálních mononukleárních buněk. Infiltráty byly složeny primárně z T buněk, monocytů, makrofágů, myeloidních DC, NK buněk a v menší míře plazmacytoidních DC (Adams et al., 2008). Poly ICLC však působí na různé PRR, MDA-5 a TLR-3, a pravděpodobně lokálně indukuje sekreci IFN typu I. Imunomodulační účinky poly ICLC in situ se pravděpodobně liší od účinků imichimodu. Kombinace imunohistochemického hodnocení buněčných infiltrátů indukovaných poly ICLC spolu s analýzou genového pole jeho transkripčních účinků na celou kůži z místa vpichu může pomoci objasnit místní události a mechanismy, kterými poly ICLC uplatňuje adjuvantní účinek.

Díky spolupráci s naším spolupracovníkem Rafickem Sekalym, který použil systémovou biologii k monitorování vrozených a adaptivních reakcí na vakcínu proti žluté zimnici a další kohorty pacientů (Gaucher et al., 2008), můžeme pochopit adjuvantní poruchu imunitní funkce. Vzorky krve a kůže odebrané od dobrovolníků studie budou zaslány do laboratoře Dr. Sekalyho v Institutu vakcíny a genové terapie, kde budou prováděny transkripční čipy a bioinformatické analýzy vysokého řádu, aby se získalo globální pochopení vrozených imunitních reakcí na poly ICLC.

Navrhovaná studie je otevřenou studií pro hodnocení vrozených imunitních reakcí vyvolaných poly ICLC u zdravých dobrovolníků. Cílem studie je charakterizovat transkripční změny indukované subkutánním podáním poly ICLC na různé typy krevních buněk a charakterizovat buněčné infiltráty a transkripční změny v místě injekce poly ICLC.

Primární hypotéza Podání poly ICLC zdravým dobrovolníkům vyvolá odlišné transkripční změny v různých typech krevních buněk, včetně různých podskupin DC.

Sekundární hypotéza Podání poly ICLC zdravým dobrovolníkům vyvolá zřetelné transkripční změny a T buňky a myeloidní buňky infiltrují do kůže v místě injekce.

Primární cíl:

Vyhodnotit vrozené imunitní odpovědi na poly ICLC u různých typů krevních buněk, včetně tří podskupin dendritických buněk po subkutánním podání zdravým dobrovolníkům.

Sekundární cíle:

• Vyhodnotit vrozené imunitní reakce na poly ICLC v místě vpichu.
• Vyhodnotit reprodukovatelnost vrozených imunitních odpovědí v celých PBMC po druhé dávce poly ICLC u dobrovolníků, kteří se účastnili protokolu MAC-682 a nyní se vracejí k účasti na této navrhované studii.

Primární výsledek(y):

• Transkripční čipy v celých PBMC a v 8 podskupinách krevních leukocytů (naivní a paměťové T, NK, B, monocyty a tři různé podskupiny dendritických buněk (BDCA1+, BDCA3+ a BDCA2+ plazmocytoidní DC) po s.c. podávání poly ICLC.
• Průtoková cytometrická analýza aktivačních markerů v různých podskupinách krevních leukocytů.
• Měření cytokinů v séru a/nebo plazmě po s.c. podávání poly ICLC.

Sekundární výsledek(y):

• Rutinní histologie a imunohistochemie pro hodnocení buněčných infiltrátů po subkutánní injekci poly ICLC.
• Transkripční analýza vzorků kůže z místa vpichu studovaného léku a z místa kůže bez lézí.
• Transkripční analýza celých vzorků PBMC v různých časových bodech po první dávce a druhé dávce poly ICLC u dobrovolníků, kteří se účastnili protokolu MAC-682 a nyní se vracejí k účasti na této navrhované studii.

Metody a postupy:

Dotazník před screeningem Potenciální účastníci nejprve absolvují předběžný screening po telefonu, aby posoudili anamnézu a kvalifikaci pro studii (Příloha C – Dotazník před screeningem). Potenciální dobrovolníci budou mít v tuto chvíli příležitost diskutovat o studii a klást otázky náboráři do studie. Ti, kteří jsou způsobilí a mají zájem o účast, se zúčastní screeningové návštěvy v ambulanci Rockefellerovy nemocnice.

Screeningová návštěva

Během screeningové návštěvy zodpoví personál studie jakékoli dotazy týkající se studie. Před provedením jakýchkoli studijních postupů bude získán písemný informovaný souhlas. Aby byl zajištěn informovaný souhlas, hlavní zkoušející nebo pověřená osoba prodiskutuje s každým dobrovolníkem individuálně následující procesy a vysvětlení:

1. Poradenství před HIV testem.
2. Sexuálně aktivní dobrovolníci by měli používat spolehlivou formu antikoncepce od screeningu až do 6 týdnů po podání léku.

Pokud dobrovolník souhlasí s účastí, pracovníci webu:

• Proveďte kompletní anamnézu (včetně souběžné medikace);
• Proveďte obecné fyzikální vyšetření včetně výšky, hmotnosti, vitálních funkcí (puls, dechová frekvence, krevní tlak a teplota), vyšetření kůže, dýchacího, kardiovaskulárního a břišního systému a posouzení krčních a axilárních lymfatických uzlin;
• Odebírejte vzorky krve a moči pro všechny testy, jak je uvedeno v Plánu postupů (Příloha A);
• Proveďte těhotenský test pro všechny dobrovolnice.

Screeningový laboratorní test (testy) lze opakovat podle uvážení hlavního zkoušejícího nebo zmocněnce, aby se prozkoumaly jakékoli izolované abnormality.

Pokud se screeningová návštěva uskuteční více než 45 dní před datem podání léku, musí se studijní postupy pro screeningovou návštěvu opakovat. Úplná anamnéza však může být nahrazena prozatímní anamnézou a formulář informovaného souhlasu může být přezkoumán bez dalšího podepisování.

Návštěva administrativy léčiv (den 0)

Před podáním studovaného léku pracovníci pracoviště:

• Odpovězte na jakékoli otázky týkající se studie;
• Přezkoumat prozatímní lékařskou anamnézu (včetně souběžných léků);
• Prohlédněte si bezpečnostní laboratorní data;
• Zkontrolujte formulář informovaného souhlasu, který jste obdrželi při screeningové návštěvě u dobrovolníka;
• Proveďte řízené fyzikální vyšetření včetně vitálních funkcí (puls, dechová frekvence, krevní tlak a teplota), stejně jako posouzení axilárních lymfatických uzlin a jakékoli další vyšetření indikované anamnézou nebo pozorováním;
• Odebírejte vzorky krve a moči pro všechny testy, jak je uvedeno v Plánu postupů (Příloha A);
• Proveďte těhotenský test pro všechny dobrovolnice (bude zaslána krev) a získejte výsledky před podáním léku
• Proveďte základní hodnocení místa studovaného léku a vyhodnoťte a zaznamenejte veškeré systémové příznaky;
• Podávejte zkoumaný lék (místy vpichu mohou být horní paže, stehna nebo hýždě)
• U dobrovolníků, kteří souhlasili s podstoupením kožních biopsií, budou provedeny dvě kožní biopsie: jedna v místě kůže kontralaterálně k místu injekce a druhá v místě injekce, 6 hodin po podání studovaného léku. Dvě vybraná místa na kůži pro biopsii budou vyčištěna povidon-jodem a anestetizována injekcí 1-2 % xylokainu. L.M.X.4 (Lidocaine 4%) může být také aplikován topický anestetický krém. Budou odebrány dvě biopsie kůže (6 mm). Rány budou sešity a aplikovány sterilní obvazy. Tento postup zanechává malou a trvalou jizvu.
• Dobrovolník bude mít možnost zůstat v nemocnici přes noc před podáním studovaného léku nebo placeba a/nebo den podání studijního léku pro pohodlí („strávníci“) nebo být naplánován jako denní pacient

Dobrovolníci budou pečlivě sledováni po dobu nejméně 30 - 45 minut po podání drogy. Vitální funkce (puls, dechová frekvence, krevní tlak a teplota) budou monitorovány 30 - 45 minut po vakcinaci a zaznamenány. Jakékoli místní a systémové události reaktogenity, stejně jako jakékoli jiné události, které nastanou, budou zaznamenány po 30 - 45 minutách. Dobrovolníci dostanou deník (příloha B) a budou požádáni, aby zaznamenali všechny události reaktogenity, ke kterým dojde v prvním dni po podání léku a mezi dny 1 a 3 a mezi dny 3 a 7. Pracovníci místa vysvětlí dobrovolníkovi, jak zaznamenat reaktogenitu Události.

Pro zdokumentování místa vpichu a případných změn po injekci bude provedena lékařská fotografie. Totožnost dobrovolníka bude utajena.

Den 1 Návštěva po podání léku

• Přehled prozatímní lékařské anamnézy a užívání souběžných léků;
• Pokud jsou přítomny příznaky, proveďte fyzické vyšetření zaměřené na příznaky;
• Posoudit místní a systémovou reaktogenitu, jakož i jakékoli další nežádoucí účinky;
• Odeberte vzorky krve a moči pro všechny testy, jak je uvedeno v Plánu postupů (Příloha A).
• U dobrovolníků, kteří souhlasili s podstoupením kožních biopsií, bude provedena jedna dodatečná kožní biopsie 1 den po podání studovaného léku v místě vpichu. Vybrané místo kůže pro biopsii bude vyčištěno povidon-jodem a anestetizováno injekcí 1-2% xylokainu. L.M.X.4 (Lidocaine 4%) může být také aplikován topický anestetický krém. Bude odebrána jedna biopsie kůže (6 mm). Rána se sešije a aplikuje se sterilní obvaz. Tento postup zanechává malou a trvalou jizvu.

Návštěvy po podání léku

Dobrovolníci budou požádáni, aby se vrátili na kliniku 2, 3 a 7 dní po podání studovaného léku. V těchto dnech bude probíhat:

• Přehled prozatímní lékařské anamnézy a užívání souběžných léků;
• Pokud jsou přítomny příznaky, proveďte fyzické vyšetření zaměřené na příznaky;
• Posoudit místní a systémovou reaktogenitu, jakož i jakékoli další nežádoucí účinky;
• Odebírejte vzorky krve a moči pro všechny testy, jak je uvedeno v Plánu postupů (Příloha A);

Následná návštěva

Ve 2. týdnu budou dobrovolníci požádáni, aby se vrátili na kliniku k dodatečnému posouzení bezpečnosti a imunogenicity. Na této návštěvě bude probíhat:

• Přehled prozatímní lékařské anamnézy a užívání souběžných léků;
• Pokud jsou přítomny příznaky, proveďte fyzické vyšetření zaměřené na příznaky;
• Posoudit případné nežádoucí příhody;
• Odebírejte vzorky krve a moči pro všechny testy, jak je uvedeno v Plánu postupů (Příloha A);
• Odstranění stehů po volitelných biopsiích kůže, pokud se biopsie provádějí.

Vzorky nebudou odeslány našemu spolupracovníkovi, Dr. Raficku Sekalymu, dokud jeho schválení IRB nebude přijato a zkontrolováno Rockefellerovou IRB.