Detección de ADN bacteriano y metabolismo del colágeno en tendones de Aquiles con ruptura aguda

Objetivos

1. Investigar el recambio de colágeno en los tendones de Aquiles antes de una ruptura.
2. Investigar el recambio relativo de colágeno en los tendones de Aquiles los días inmediatamente posteriores a una ruptura.
3. Investigar la tasa de síntesis aguda de proteína de colágeno en los tendones de Aquiles con ruptura aguda.
4. Investigar si el ADN bacteriano está presente en muestras de tejido degenerativo en tendones de Aquiles con ruptura aguda en comparación con muestras de tejido sano del tendón roto.

Fondo

Las rupturas de tendones son lesiones graves que potencialmente conducen a una función reducida, actividad reducida y licencia por enfermedad. En individuos más jóvenes, deportistas activos con tendones fuertes, generalmente se necesita un evento traumático agudo para desencadenar una ruptura. Con la edad, los tendones están expuestos a cambios degenerativos y, por lo tanto, pueden romperse en las actividades cotidianas (espontáneamente).

La etiología y la patogenia de las roturas espontáneas de tendones son complejas y no se conocen por completo. Es bien sabido que se asocian a alteraciones patológicas preexistentes, similares a los cambios observados en la tendinopatía. Recientemente, Dakin et al. encontró que los tendones de Aquiles rotos muestran evidencia de inflamación crónica (que no se resuelve). La afección podría ser el resultado de una lesión colagenolítica seguida de una cicatrización fallida del tendón. Sin embargo, otras teorías siguen siendo muy debatidas.

Se han propuesto muchos factores predisponentes que contribuyen a las alteraciones patológicas de los tendones. Los estudios encontraron que factores como el aumento de la edad, el brazo dominante, los antecedentes de trauma y la anatomía acromial específica están asociados con el desgarro del manguito de los rotadores. Se sugiere que las rupturas espontáneas de tendón, tendón de Aquiles primario, están relacionadas con esteroides sistémicos e inyectables, uso de fluoroquinolonas y algunas enfermedades reumáticas. Además, los estudios han demostrado posibles asociaciones entre los factores genéticos y la lesión del tendón. Los factores mencionados pueden influir en el inicio y desarrollo de las alteraciones patológicas que debilitan los tendones. Sin embargo, es seguro que existen otros mecanismos y factores predisponentes que necesitan ser investigados.

Heinemeier et al. descubrió que la mayor parte de la matriz de colágeno del núcleo del tendón de Aquiles humano sano es una estructura esencialmente permanente que se deposita durante el crecimiento en altura y tiene una rotación limitada en adultos. Los hallazgos se basaron en el método de pulso de bomba de 14C, y los datos no publicados del mismo grupo de investigación (usando este método) indican que una tasa anormalmente alta de recambio de colágeno precede a los síntomas de uso excesivo del tendón (tendinopatía) Es de gran interés investigar si el aumento de la producción de colágeno predispone a la rotura del tendón.

Recientemente, Rolf et al. demostró la presencia de ADN bacteriano en el 25% de las muestras de tendones de Aquiles rotos. Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para identificar el gen bacteriano 16S rDNA altamente conservado en los tendones. Este hallazgo abre la pregunta de si los depósitos bacterianos juegan un papel en la etiología de las rupturas espontáneas de tendones. Para prevenir las rupturas de tendones, es esencial mejorar nuestra comprensión de la etiología. Una mejor comprensión también puede conducir al desarrollo de nuevas opciones terapéuticas.

En este estudio transversal, nuestro objetivo es investigar si las bacterias contribuyen potencialmente a la etiología de la ruptura aguda del tendón de Aquiles. Además, también investigamos si las rupturas del tendón están precedidas por un aumento en la renovación del colágeno.

Diseño del estudio

El estudio se realiza como un estudio transversal. Se incluyen pacientes con rotura aguda del tendón de Aquiles El estudio pretende incluir 20 pacientes con rotura aguda del tendón de Aquiles.

El procedimiento para el paciente:

1. El día de la inclusión, los pacientes habrán tomado una muestra de sangre e ingerido 150ml de óxido de deuterio (D2O).
2. El día de la cirugía, el paciente se reunirá 3 horas antes del inicio de la cirugía. Se inyectará un bolo de isótopo estable (trazador de prolina marcado con 15N) y luego se infundirá de forma continua a través de la vena antecubital. Se toman muestras de sangre antes de que comience la infusión, 30 minutos después, 60 minutos después, 120 minutos después y cuando se toman las biopsias.

3. Durante la cirugía, los pacientes habrán tomado:

   1. Dos biopsias del extremo del muñón del tendón o ligamento roto.
   2. Dos biopsias de control 2-4 cm proximales al extremo del muñón del tendón de Aquiles roto.

Procedimiento para biopsias

Todas las biopsias son tomadas por cirujanos ortopédicos capacitados. Cada biopsia se toma durante la cirugía en un quirófano. Antes del inicio de la cirugía se prepara una mesa estéril que contiene tres paquetes de bisturí y fórceps estériles, y 8 contenedores para biopsias con la seguridad social (CPR) del paciente, el tipo de análisis y un número continuo describiendo individualmente cada biopsia.

Los 8 contenedores contendrán:

1. Biopsia del extremo del muñón del tendón roto para el análisis de ADNr 16S.
2. Biopsia del extremo del muñón del tendón roto para el método de pulso de bomba 14C
3. Biopsia del extremo del muñón del tendón roto para análisis de isótopos (óxido de deuterio y prolina marcada con 15N).
4. Biopsia del extremo del muñón del tendón roto para el análisis del ARNm.
5. Biopsia del tendón roto 2-4 cm proximal al extremo del muñón para el análisis de ADNr 16S.
6. Biopsia del tendón roto 2-4 cm proximal al extremo del muñón para pulso de bomba 14C.
7. Biopsia del tendón roto 2-4 cm proximal al extremo del muñón para análisis de isótopos (óxido de deuterio y prolina marcada con 15N).
8. Biopsia del tendón roto 2-4 cm proximal al extremo del muñón para análisis de ARNm

Biopsias de tendones rotos

Tendón de Aquiles:

Las biopsias se toman durante una cirugía abierta. Para evitar la contaminación de las biopsias se sigue el siguiente procedimiento:

1. Frotamiento quirúrgico y colocación de paños quirúrgicos de acuerdo con las pautas habituales.
2. Incisión y disección de la piel según las pautas habituales.
3. A medida que se identifica el tendón roto, se abre un nuevo paquete que contiene un bisturí estéril y unas pinzas. Los instrumentos solo se utilizan para tomar la biopsia y no entran en contacto con el tejido circundante.
4. Se toman 2 biopsias, de 10 mm de largo, 1 mm de ancho y 1 mm de profundidad, del tejido del tendón degenerado en el sitio de ruptura.
5. La primera biopsia se coloca en un recipiente (para la detección de bacterias). En una tabla estéril, la segunda biopsia se divide en tres y se coloca en tres contenedores diferentes (uno para pulso de bomba de 14C, uno para análisis de isótopos (tanto óxido de deuterio como prolina marcada con 15N) y uno para ARNm). Estos contenedores se congelan hasta -80oC.
6. Se abre un segundo paquete nuevo que contiene un bisturí estéril y unas pinzas y se toman 2 biopsias de 10 mm de largo, 1 mm de ancho y 1 mm de profundidad, 2-4 cm proximales al sitio de la ruptura.
7. La primera biopsia se coloca en un recipiente (para detección bacteriana) Sobre una tabla estéril, la segunda biopsia se divide en tres y se coloca en tres recipientes diferentes (uno para pulso de bomba de 14C, otro para análisis de isótopos (tanto óxido de deuterio como prolina marcada con 15N) ) y uno para ARNm). Estos contenedores se congelan hasta -80oC.

Pruebas de contaminación

PCR y secuenciación: en la prueba se incluye un control tanto negativo como positivo. Los números de ciclos en muestras positivas también se incluirán en la interpretación. Es probable que se consideren contaminantes las especies bacterianas exclusivamente ambientales que nunca se han relacionado con enfermedades humanas.

Cultivo de sangre: durante la cirugía, se envía una muestra de sangre para un cultivo para investigar si se presentaron bacterias en la sangre.

Cultivos bacterianos: se realizan pruebas de cultivo bacteriano en todos los pacientes. Las muestras investigadas se toman con intercambios de:

• Área de piel del paciente sobre el sitio quirúrgico.
• La hoja del bisturí usado.

Los intercambios se recogen en tubos de vidrio separados y se envían al Departamento de Microbiología, Hvidovre Hospi-tal. Los intercambios se prueban en múltiples medios de cultivo para múltiples especies.

Cegamiento del análisis

Por cada paciente incluido, los 2 contenedores con biopsias para detección bacteriana obtendrán un número continuo aleatorio. Estos números pueden, a través de un documento clave (formulario en papel), revelar si la biopsia se ha tomado del tejido degenerativo o del tejido sano. La persona responsable del análisis del ADN bacteriano no tiene acceso al documento clave.

Registro de datos durante la inclusión

• ID del paciente
• Número de seguro social
• Número de teléfono
• Edad
• Peso
• Fecha de examinacion
• Fecha y hora del insulto
• Inyección de corticosteroides (número y tiempo)
• Historia de infección