Détection de l'ADN bactérien et du métabolisme du collagène dans les tendons d'Achille gravement rompus

Objectifs

1. Étudier le renouvellement du collagène dans les tendons d'Achille avant une rupture.
2. Étudier le renouvellement relatif du collagène dans les tendons d'Achille les jours suivant immédiatement une rupture.
3. Étudier le taux de synthèse aiguë des protéines de collagène dans les tendons d'Achille en rupture aiguë.
4. Rechercher si de l'ADN bactérien est présent dans des échantillons de tissus dégénératifs de tendons d'Achille gravement rompus par rapport à des échantillons de tissus sains du tendon rompu.

Arrière-plan

Les ruptures de tendon sont des blessures graves qui peuvent entraîner une fonction réduite, une activité réduite et un arrêt de travail. Chez les jeunes, les sportifs actifs avec des tendons forts, un événement traumatique aigu est généralement nécessaire pour déclencher une rupture. Avec l'âge, les tendons sont exposés à des changements dégénératifs et peuvent donc se rompre dans les activités quotidiennes (spontanément).

L'étiologie et la pathogenèse des ruptures tendineuses spontanées sont complexes et mal comprises. Il est bien connu qu'ils sont associés à des altérations pathologiques préexistantes, similaires aux changements observés dans les tendinopathies. Récemment, Dakin et al. ont constaté que les tendons d'Achille rompus montrent des signes d'inflammation chronique (non résolutive). La condition pourrait être le résultat d'une lésion collagénolytique suivie d'un échec de la guérison du tendon. Pourtant, d'autres théories sont encore très débattues.

De nombreux facteurs prédisposants ont été proposés pour contribuer aux altérations pathologiques des tendons. Des études ont montré que des facteurs tels que l'âge, le bras dominant, les antécédents de traumatisme et l'anatomie acromiale spécifique sont associés à la déchirure de la coiffe des rotateurs. Il est suggéré que les ruptures tendineuses spontanées, tendon d'Achille primaire, soient liées aux stéroïdes systémiques et injectables, à l'utilisation de fluoroquinolones et à certaines maladies rhumatismales. De plus, des études ont montré des associations possibles entre les facteurs génétiques et les lésions tendineuses. Les facteurs mentionnés peuvent influencer l'initiation et le développement des altérations patho-logiques qui affaiblissent les tendons. Cependant, il est certain qu'il existe d'autres mécanismes et facteurs prédisposants qui doivent être étudiés.

Heinemeier et al. ont constaté que la majeure partie de la matrice de collagène du noyau du tendon d'Achille humain sain est une structure essentiellement permanente qui se dépose pendant la croissance en hauteur et a un renouvellement limité chez les adultes. Les résultats étaient basés sur la méthode d'impulsion de la bombe 14C, et des données non publiées du même groupe de recherche (utilisant cette méthode) indiquent qu'un taux anormalement élevé de renouvellement du collagène précède les symptômes de surutilisation des tendons (tendinopathie). Il est très intéressant d'enquêter si l'augmentation du renouvellement du collagène prédispose à la rupture du tendon.

Récemment, Rolf et al. ont démontré la présence d'ADN bactérien dans 25 % des prélèvements de tendons d'Achille rompus. La réaction en chaîne de la polymérase (PCR) a été utilisée pour identifier le gène d'ADNr 16S bactérien hautement conservé dans les tendons. Cette découverte ouvre la question, si les dépôts bactériens jouent un rôle dans l'étiologie des ruptures tendineuses spontanées Afin de prévenir les ruptures tendineuses, il est essentiel d'améliorer notre compréhension de l'étiologie. Une meilleure compréhension peut également conduire au développement de nouvelles options thérapeutiques.

Dans cette étude transversale, nous visons à déterminer si les bactéries contribuent potentiellement à l'étiologie de la rupture aiguë du tendon d'Achille. De plus, nous examinons également si les ruptures de tendon sont précédées d'un renouvellement accru du collagène.

Conception de l'étude

L'étude est menée comme une étude transversale. Les patients présentant une rupture aiguë du tendon d'Achille sont inclus L'étude vise à inclure 20 patients présentant une rupture aiguë du tendon d'Achille.

La procédure pour le patient:

1. Au jour de l'inclusion, les patients auront prélevé un échantillon de sang et ingéré 150 ml d'oxyde de deutérium (D2O).
2. Le jour de l'intervention, le patient se réunira 3 heures avant le début de l'intervention. Un bolus d'isotope stable (traceur proline marqué 15N) sera injecté puis perfusé en continu dans la veine antécubitale. Des échantillons de sang sont prélevés avant le début de la perfusion, 30 min après, 60 min après, 120 min après et au moment des biopsies.

3. Pendant la chirurgie, les patients auront pris :

   1. Deux biopsies de l'extrémité du moignon du tendon ou du ligament rompu.
   2. Deux biopsies de contrôle à 2-4 cm en amont de l'extrémité du moignon du tendon d'Achille rompu.

Procédure pour les biopsies

Toutes les biopsies sont prises par des chirurgiens orthopédistes qualifiés. Chaque biopsie est prise pendant la chirurgie dans une salle d'opération. Avant le début de l'intervention, une table stérile est préparée contenant trois packs de scalpels et pinces stériles, et 8 conteneurs pour biopsies avec la sécurité sociale du patient (CPR), le type d'analyse et un numéro continu décrivant individuellement chaque biopsie.

Les 8 conteneurs contiendront :

1. Biopsie de l'extrémité du moignon du tendon rompu pour l'analyse de l'ADNr 16S.
2. Biopsie de l'extrémité du moignon du tendon rompu pour la méthode d'impulsion de la bombe 14C
3. Biopsie de l'extrémité du moignon du tendon rompu pour analyse isotopique (oxyde de deutérium et proline marquée 15N).
4. Biopsie de l'extrémité du moignon du tendon rompu pour l'analyse de l'ARNm.
5. Biopsie du tendon rompu à 2-4 cm en amont de l'extrémité du moignon pour l'analyse de l'ADNr 16S.
6. Biopsie du tendon rompu à 2-4 cm en amont de l'extrémité du moignon pour une impulsion de bombe au 14C.
7. Biopsie du tendon rompu à 2-4 cm en amont de l'extrémité du moignon pour analyse isotopique (oxyde de deutérium et proline marquée 15N).
8. Biopsie du tendon rompu à 2-4 cm en amont de l'extrémité du moignon pour l'analyse de l'ARNm

Biopsies de tendons rompus

Tendon d'Achille:

Les biopsies sont réalisées en chirurgie ouverte. Pour éviter la contamination des biopsies, la procédure suivante est suivie :

1. Frottement chirurgical et drapage selon les directives normales.
2. Incision cutanée et dissection selon les directives normales.
3. Au fur et à mesure que le tendon rompu est identifié, un nouveau pack contenant un scalpel stérile et une pince est ouvert. Les instruments ne sont utilisés que pour effectuer la biopsie et n'entrent pas en contact avec les tissus environnants.
4. 2 biopsies, de 10 mm de long, 1 mm de large et 1 mm de profondeur, sont prélevées sur le tissu tendineux dégénéré au site de rupture.
5. La première biopsie est placée dans un récipient (pour la détection bactérienne). Sur une planche stérile, la deuxième biopsie est divisée en trois et placée dans trois conteneurs différents (un pour l'impulsion de la bombe 14C, un pour l'analyse isotopique (à la fois l'oxyde de deutérium et la proline marquée 15N) et un pour l'ARNm). Ces contenants sont congelés jusqu'à -80oC.
6. Un deuxième nouveau paquet contenant un scalpel stérile et une pince est ouvert et 2 biopsies de 10 mm de long, 1 mm de large et 1 mm de profondeur sont prélevées à 2-4 cm en amont du site de rupture.
7. La première biopsie est placée dans un récipient (pour la détection bactérienne) Sur une planche stérile, la deuxième biopsie est divisée en trois et placée dans trois récipients différents (un pour l'impulsion de la bombe 14C, un pour l'analyse isotopique (à la fois l'oxyde de deutérium et la proline marquée 15N ) et un pour l'ARNm). Ces contenants sont congelés jusqu'à -80oC.

Essais de contamination

PCR et séquençage - Un contrôle négatif et un contrôle positif sont inclus dans le test. Le nombre de cycles dans les échantillons positifs sera également inclus dans l'interprétation. Les espèces bactériennes exclusivement environnementales qui n'ont jamais été associées à une maladie humaine sont susceptibles d'être considérées comme des contaminants.

Hémoculture - Pendant la chirurgie, un échantillon de sang est envoyé pour culture afin de déterminer si des bactéries ont été présentes dans le sang.

Cultures bactériennes - Des tests de culture bactérienne sont effectués sur tous les patients. Les échantillons étudiés sont prélevés avec des swaps de :

• Zone de peau du patient sur le site chirurgical.
• La lame du scalpel utilisé.

Les swaps sont collectés dans des tubes de verre séparés et envoyés au Département de microbiologie, Hvidovre Hospi-tal. Les échanges sont testés sur plusieurs milieux de culture pour plusieurs espèces.

Blindage de l'analyse

Pour chaque patient inclus, les 2 conteneurs avec des biopsies pour la détection bactérienne recevront un numéro continu aléatoire. Ces chiffres peuvent, via un document clé (formulaire papier), révéler si la biopsie a été prélevée sur le tissu dégénératif ou sur le tissu sain. La personne responsable de l'analyse de l'ADN bactérien n'a pas accès au document clé.

Enregistrement des données lors de l'inclusion

• ID du patient
• Numéro de sécurité sociale
• Numéro de téléphone
• Âge
• Lester
• Date d'examen
• Date et heure de l'insulte
• Injection de corticostéroïdes (nombre et heure)
• Antécédents d'infection