Rilevamento del DNA batterico e del metabolismo del collagene nei tendini di Achille con rottura acuta

Obiettivi

1. Per studiare il turnover del collagene nei tendini di Achille prima di una rottura.
2. Indagare il turnover relativo del collagene nei tendini di Achille nei giorni immediatamente successivi a una rottura.
3. Per studiare il tasso di sintesi acuta della proteina del collagene nei tendini di Achille rotti acutamente.
4. Per indagare se il DNA batterico è presente nei campioni del tessuto degenerativo nei tendini di Achille rotti acutamente rispetto ai campioni del tessuto sano del tendine rotto.

Sfondo

Le rotture del tendine sono lesioni gravi che potenzialmente portano a una ridotta funzionalità, ridotta attività e congedo per malattia. Negli individui più giovani e sportivi con tendini forti, di solito è necessario un evento traumatico acuto per innescare una rottura. Con l'età i tendini sono esposti a cambiamenti degenerativi e possono quindi rompersi nelle attività quotidiane (spontaneamente).

L'eziologia e la patogenesi delle rotture tendinee spontanee sono complesse e non completamente comprese. È noto che sono associati ad alterazioni patologiche preesistenti, simili ai cambiamenti osservati nella tendinopatia. Recentemente, Dakin et al. scoperto che i tendini di Achille rotti mostrano segni di infiammazione cronica (non risolutiva). La condizione potrebbe essere il risultato di una lesione collagenolitica seguita da una mancata guarigione del tendine. Tuttavia, altre teorie sono ancora molto dibattute.

Molti fattori predisponenti sono stati proposti per contribuire alle alterazioni patologiche dei tendini. Gli studi hanno scoperto che fattori come l'aumento dell'età, il braccio dominante, la storia del trauma e l'anatomia acromiale specifica sono associati alla rottura della cuffia dei rotatori. Si suggerisce che le rotture spontanee del tendine, tendine d'Achille primario, siano correlate agli steroidi sistemici e iniettabili, all'uso di fluorochinoloni e ad alcune malattie reumatiche. Inoltre, gli studi hanno mostrato possibili associazioni tra fattori genetici e lesioni ai tendini. I suddetti fattori possono influenzare l'insorgenza e lo sviluppo delle alterazioni patologiche che indeboliscono i tendini. Tuttavia, è certo che ci sono altri meccanismi e fattori predisponenti che devono essere studiati.

Heinemeier et al. ha scoperto che la maggior parte della matrice di collagene del nucleo del tendine di Achille umano sano è una struttura essenzialmente permanente che si deposita durante la crescita in altezza e ha un turnover limitato negli adulti. I risultati erano basati sul metodo dell'impulso bomba 14C e dati non pubblicati dallo stesso gruppo di ricerca (utilizzando questo metodo) indicano che un tasso anormalmente alto di turnover del collagene precede i sintomi di un uso eccessivo del tendine (tendinopatia). È di grande interesse indagare se l'aumento del turnover del collagene predispone alla rottura del tendine.

Recentemente, Rolf et al. dimostrato la presenza di DNA batterico nel 25% dei campioni di tendini di Achille rotti. La reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata utilizzata per identificare il gene batterico 16S rDNA altamente conservato nei tendini. Questa scoperta apre la questione se le deposizioni batteriche abbiano un ruolo nell'eziologia delle rotture spontanee del tendine. Al fine di prevenire le rotture del tendine è essenziale migliorare la nostra comprensione dell'eziologia. Una migliore comprensione può anche portare allo sviluppo di nuove opzioni terapeutiche.

In questo studio trasversale, miriamo a indagare se i batteri stanno potenzialmente contribuendo all'eziologia della rottura acuta del tendine di Achille, inoltre, indaghiamo anche se le rotture del tendine sono precedute da un aumento del turnover del collagene.

Progettazione dello studio

Lo studio è condotto come uno studio trasversale. Sono inclusi i pazienti con rottura acuta del tendine di Achille Lo studio mira a includere 20 pazienti con rottura acuta del tendine di Achille.

La procedura per il paziente:

1. Il giorno dell'inclusione, i pazienti avranno prelevato un campione di sangue e ingerito 150 ml di ossido di deuterio (D2O).
2. Il giorno dell'intervento, il paziente si incontrerà 3 ore prima dell'inizio dell'intervento. Verrà iniettato un bolo di isotopo stabile (proline tracciante marcato 15N) e successivamente infuso continuo attraverso la vena antecubitale. I campioni di sangue vengono prelevati prima dell'inizio dell'infusione, 30 minuti dopo, 60 minuti dopo, 120 minuti dopo e quando vengono prelevate le biopsie.

3. Durante l'intervento, i pazienti avranno preso:

   1. Due biopsie dall'estremità del moncone del tendine o del legamento rotto.
   2. Due biopsie di controllo 2-4 cm prossimali all'estremità del moncone del tendine di Achille rotto.

Procedura per biopsie

Tutte le biopsie vengono prelevate da chirurghi ortopedici qualificati. Ogni biopsia viene prelevata durante un intervento chirurgico in una sala operatoria. Prima dell'inizio dell'intervento viene preparato un tavolo sterile contenente tre confezioni di bisturi e pinze sterili e 8 contenitori per biopsie con l'assicurazione sociale del paziente (RCP), il tipo di analisi e un numero continuo che descrive individualmente ogni biopsia.

Gli 8 contenitori conterranno:

1. Biopsia dall'estremità del moncone del tendine rotto per l'analisi del 16S rDNA.
2. Biopsia dall'estremità del moncone del tendine rotto per il metodo dell'impulso bomba 14C
3. Biopsia dall'estremità del moncone del tendine rotto per l'analisi degli isotopi (ossido di deuterio e prolina marcata 15N).
4. Biopsia dall'estremità del moncone del tendine rotto per l'analisi dell'mRNA.
5. Biopsia del tendine rotto 2-4 cm prossimalmente all'estremità del moncone per l'analisi del 16S rDNA.
6. Biopsia del tendine rotto 2-4 cm prossimalmente all'estremità del moncone per il polso bomba 14C.
7. Biopsia del tendine rotto 2-4 cm prossimalmente all'estremità del moncone per l'analisi degli isotopi (ossido di deuterio e prolina marcata 15N).
8. Biopsia dal tendine rotto 2-4 cm prossimalmente all'estremità del moncone per l'analisi dell'mRNA

Biopsie da tendini rotti

Tendine d'Achille:

Le biopsie vengono prelevate durante la chirurgia a cielo aperto. Per prevenire la contaminazione delle biopsie si segue la seguente procedura:

1. Strofinamento chirurgico e drappeggio secondo le normali linee guida.
2. Incisione cutanea e dissezione secondo le normali linee guida.
3. Una volta identificato il tendine rotto, viene aperta una nuova confezione contenente un bisturi sterile e una pinza. Gli strumenti vengono utilizzati solo per eseguire la biopsia e non entrano in contatto con il tessuto circostante.
4. 2 biopsie, lunghe 10 mm, larghe 1 mm e profonde 1 mm, vengono prelevate dal tessuto tendineo degenerato nel sito di rottura.
5. La prima biopsia viene posta in un contenitore (per il rilevamento batterico). Su una piastra sterile, la seconda biopsia viene divisa in tre e collocata in tre diversi contenitori (uno per il 14C bomb pulse, uno per l'analisi degli isotopi (sia ossido di deuterio che prolina marcata 15N) e uno per mRNA). Questi contenitori sono congelati fino a -80oC.
6. Viene aperta una seconda nuova confezione contenente un bisturi sterile e una pinza e vengono prelevate 2 biopsie lunghe 10 mm, larghe 1 mm e profonde 1 mm 2-4 cm prossimalmente al sito di rottura.
7. La prima biopsia viene posta in un contenitore (per il rilevamento batterico) Su una tavola sterile, la seconda biopsia viene divisa in tre e collocata in tre diversi contenitori (uno per l'impulso bomba 14C, uno per l'analisi degli isotopi (entrambi ossido di deuterio e prolina marcata 15N ) e uno per l'mRNA). Questi contenitori sono congelati fino a -80oC.

Prove di contaminazione

PCR e sequenziamento - Nel test sono inclusi sia un controllo negativo che uno positivo. Nell'interpretazione saranno inclusi anche i numeri di cicli nei campioni positivi. Le specie batteriche esclusivamente ambientali che non sono mai state correlate a malattie umane possono essere considerate contaminanti.

Emocoltura - Durante l'intervento chirurgico, viene inviato un campione di sangue per la coltura per verificare se i batteri sono stati presenti nel sangue.

Colture batteriche - I test di coltura batterica vengono condotti su tutti i pazienti. I campioni indagati sono prelevati con permuta da:

• Area della pelle del paziente sopra il sito chirurgico.
• La lama del bisturi usato.

Gli scambi vengono raccolti in tubi di vetro separati e inviati al Dipartimento di Microbiologia, ospedale di Hvidovre. Gli scambi vengono testati su più terreni di coltura per più specie.

Accecamento dell'analisi

Per ogni paziente incluso, i 2 contenitori con biopsie per il rilevamento batterico riceveranno un numero continuo randomizzato. Questi numeri possono, tramite un documento chiave (modulo cartaceo), rivelare se la biopsia è stata prelevata dal tessuto degenerato o dal tessuto sano. La persona responsabile dell'analisi del DNA batterico non ha accesso al documento chiave.

Registrazione dei dati durante l'inclusione

• ID paziente
• Numero di Social Security
• Numero di telefono
• Età
• Peso
• Data dell'esame
• Data e ora dell'insulto
• Iniezione di corticosteroidi (numero e ora)
• Storia dell'infezione