Synnytyksensisäisen antibioottisen ennaltaehkäisyn (IAP) vaikutus vastasyntyneen suoliston mikrobiotan kehitykseen. (MICROBIOTA-SO)

Syntyessään äidin ja ympäristön bakteerit kolonisoivat nopeasti vastasyntyneen maha-suolikanavan; ensimmäiset kolonisaattorit ovat yleensä aerobeja ja fakultatiivisia anaerobeja, joita seuraavat tiukat anaerobit (esim. Bifidobacterium spp., Bacteroides spp. ja Clostridium spp.). Suoliston mikrobiotan koostumukseen vaikuttavat useat tekijät, kuten synnytystapa, raskausikä, äidin suolen ja emättimen mikrobisto, ruokintatapa, synnytyksen jälkeinen sairaalahoito sekä antibioottien ja probioottien käyttö.

Emättimen kautta synnytettyjen ja yksinomaan rintaruokittujen imeväisten suolistomikrobistoa pidetään ihanteellisena terveenä, sillä C. difficile- ja E. coli -bakteerien määrä on pieni ja Bidifobacteria ja Lactobacilli on suuri määrä, jotka vaikuttavat positiivisesti isännän terveyteen aktivoimalla immunokompetentteja soluja. GI-kanavassa edistäen erittävän IgA:n tuotantoa ja lisäämällä neutrofiilien bakterisidistä aktiivisuutta ja soluvälitteistä immuniteettia, kuten NK-soluaktiivisuutta.

B-ryhmän streptokokki (GBS) on yksi tärkeimmistä vastasyntyneiden infektioiden ja sepsiksen aiheuttajista. Emättimen kautta syntyneet lapset voivat saada GBS:n synnytyksen aikana äidin emättimestä, kohdunkaulasta tai peräsuolesta, missä sitä esiintyy noin 10–20 prosentilla raskaana olevista naisista. 1990-luvun puolivälistä lähtien varhaisen alkaneen GBS-sepsiksen ilmaantuvuus on vähentynyt merkittävästi johtuen GBS-yleisseulonnan käyttöönotosta myöhään raskauden aikana ja siitä seuranneesta synnytyksensisäisestä antibioottiprofylaksiasta (IAP) GBS-positiivisilla naisilla.

Viimeaikaiset tiedot viittaavat siihen, että antibioottien käyttö varhaisessa iässä voi muuttaa suoliston kommensaalista mikrobiotaa, mikä heikentää terveyden ja sairauksien välistä tasapainoa myöhemmällä iällä. IAP:n vaikutusta vauvan suoliston bakteerikolonisaatioon ei ole laajalti tutkittu. Lisäksi tällä hetkellä saatavilla olevat tiedot tästä aiheesta ovat suurelta osin peräisin tutkimuksista, jotka on suoritettu käyttämällä kulttuuriin perustuvia tekniikoita. Tarkkoihin viljelypohjaisiin tuloksiin vaikuttaa kuitenkin oikean väliaineen valinta, lämpötila, happipitoisuus ja kasvuaika, ja tästä syystä vain 10-50 % koko suoliston bakteereista on helposti viljeltyjä. Molekyylitekniikoita, jotka perustuvat 16S ribosomaalisen bakteeri-RNA-geenin monistamiseen prokaryoottisten taksonien erottamiseksi, on äskettäin kehitetty suoliston mikrobiotan tutkimukseen, mikä mahdollistaa bakteeriyhteisöjen yksityiskohtaisemman karakterisoinnin kuin tavallinen viljelmä.

Olemme aiemmin arvioineet IAP:n vaikutusta suhteellisen pienessä otoksessa yksinomaan rintaruokittuja ja emättimellä syntyneitä imeväisiä molekyylitekniikoiden avulla; 7. elinpäivänä mikrobiotan koostumuksessa oli useita eroja IAP:lle altistuneiden ja altistumattomien pikkulasten välillä.

Tämän artikkelin tavoitteena on siis arvioida näitä eroja tarkemmin, laajentamalla alkuperäistä näytettä ja seuraamalla pikkulapsia kuukauden ikään asti. Myös ruokintatavan vaikutuksia mikrobiotan koostumukseen tutkitaan.

Tutkimukseen otetaan mukaan terveitä, emättimen kautta syntyneitä lapsia, joiden syntymäpaino on riittävä raskausikään nähden ja joiden äideille on tehty GBS-seulonta raskausviikolla 35-37.

Pikkulapset suljetaan pois, jos:

• ennenaikainen tai pieni/suuri raskausikään nähden
• syntynyt keisarileikkauksella
• äiti on saanut antibiootteja 4 viikkoa ennen synnytystä;
• äidin IAP suoritetaan muista syistä kuin GBS-positiivisuudesta (esim. pitkittynyt kalvojen repeämä GBS-negatiivisilla naisilla);
• äidin IAP on riittämätön;
• äidin IAP suoritetaan muilla antibiooteilla kuin ampisilliinilla, kuten erytromysiinillä;
• lapsella on vakavia synnynnäisiä epämuodostumia;
• lapselle kehittyy infektion merkkejä ja/tai hän on saanut antibioottihoitoa syntymän jälkeen;
• lapsella on vakavia kliinisiä sairauksia, jotka estävät hänen osallistumisensa tutkimukseen.

Vauvat jaetaan kahteen ryhmään äidin GBS-statuksen ja IAP:n mukaan:

• IAP-ryhmä: vauvat, jotka ovat syntyneet GBS-positiivisille äideille, jotka ovat saaneet riittävän IAP:n. GBS-profylaksiaa koskevan laitoshoitoprotokollan mukaan (johdettu CDC:n ohjeista) ampisilliinia annetaan 4 tunnin välein synnytykseen asti (ensimmäinen annos 2 g, seuraavat annokset 1 g). IAP katsotaan riittäväksi, jos äiti on saanut vähintään kaksi ampisilliiniannosta ennen synnytystä.
• Kontrolliryhmä: GBS-negatiivisten äitien lapset, jotka eivät saa antibioottihoitoa ennen synnytystä/synnytyksen aikana.

Kirjallinen tietoinen suostumus hankitaan jokaisen lapsen vanhemmalta/lailliselta huoltajalta, kun vauva on kotiutumassa päiväkodista (48-72 tuntia). Potilaiden ominaisuudet, mukaan lukien raskausaika, syntymäpaino, sukupuoli ja Apgar-pisteet 1' ja 5' syntymän jälkeen, on yhteenveto erityisessä tapausraporttilomakkeessa.

Jokaiselta lapselta otetaan kaksi ulostenäytettä seurantakäynneillä 7 ja 30 elinpäivänä. Jokaisella käynnillä tiedot painonnoususta, kliinisistä tiloista, ruokinnasta ja meneillään olevista hoidoista (esim. prebioottien, probioottien, antibioottien käyttö), kerätään vauvojen vanhemmilta.

Keräyksen jälkeen ulostenäytteet laitetaan numeroituihin kierrekorkisiin steriileihin muoviastioihin ja pakastetaan välittömästi -80 °C:seen, kunnes ne käsitellään bakteerien DNA:n uuttamista varten.

Mikrobiologisia analyyseja tehdään Bolognan yliopiston maataloustieteiden laitoksella. Analyyseja suorittavat tutkijat ovat sokeita imeväisten ryhmäidentiteetille (IAP tai kontrolliryhmä).

Kaksisataa milligrammaa ulostetta käytetään bakteerien DNA:n uuttamiseen käyttämällä QIAamp DNA Stool Mini Kit -sarjaa (QIAGEN, West Sussex, UK). Uutettua DNA:ta säilytetään -80 °C:ssa. Uutetun DNA:n puhtaus ja pitoisuus määritetään mittaamalla absorbanssin suhde aallonpituudella 260 ja 280 nm (Infinite® 200 PRO NanoQuant, Tecan, Mannedorf, Sveitsi).

Valittujen mikrobiryhmien (Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Bacteroides fragilis) kvantifiointi suoritetaan reaaliaikaisella PCR:llä. Amplifikaatiosta saadut tiedot transformoidaan bakteerisolujen lukumäärän saamiseksi grammaa kohden ulosteita, ilmaistuna logaritminä pesäkettä muodostavana yksikkönä (CFU)/g.

Saadut tiedot analysoidaan käyttämällä IBM SPSS Statistic -versiota 20.0.0 (IBM Corporation, IBM Corporation Armonk, New York, Yhdysvallat). IAP- ja kontrolliryhmien perusominaisuuksia verrataan käyttämällä riippumattomien näytteiden Mann-Whitney U -testiä jatkuville muuttujille ja khin neliö -testiä kategorisille muuttujille. IAP:n vaikutus ulosteen bakteerien määrään 7 ja 30 elinpäivänä arvioidaan käyttämällä riippumattomien näytteiden Mann-Whitney U -testiä. Hierarkkinen moninkertainen regressioanalyysi suoritetaan, jotta voidaan arvioida IAP:n vaikutus ulosteen bakteerien määrään sen jälkeen, kun pikkulasten ruokintatyyppi on kontrolloitu (koodattu kategorisena binäärimuuttujana: yksinomainen imetys vs. mikä tahansa korvikeruokinta). P-arvo