Влияние интранатальной антибиотикопрофилактики (IAP) на развитие микробиоты кишечника новорожденного. (MICROBIOTA-SO)

При рождении желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) новорожденного быстро заселяется материнскими бактериями и бактериями из окружающей среды; первыми колонизаторами обычно являются аэробы и факультативные анаэробы, за которыми следуют строгие анаэробы (например, Bifidobacterium spp., Bacteroides spp. и Clostridium spp.). На состав кишечной микробиоты влияет несколько факторов, таких как способ родов, гестационный возраст, материнская кишечная и вагинальная микробиота, тип кормления, госпитализация после рождения и использование антибиотиков и пробиотиков.

Микробиота кишечника доношенных детей, родившихся естественным путем и находящихся на исключительно грудном вскармливании, считается идеально здоровой, с низким содержанием C. difficile и E. coli и высоким количеством бидифо- и лактобактерий, которые положительно влияют на здоровье хозяина, активируя иммунокомпетентные клетки. в желудочно-кишечном тракте, способствуя выработке секреторного IgA и повышая бактерицидную активность нейтрофилов и клеточно-опосредованный иммунитет, такой как активность NK-клеток.

Стрептококк группы В (СГБ) является одной из наиболее важных причин неонатальных инфекций и сепсиса. Младенцы, рожденные естественным путем, могут заразиться СГБ в процессе родов из материнского влагалища, шейки матки или прямой кишки, где он находится примерно у 10-20% беременных женщин. С середины 90-х годов частота сепсиса с ранним началом СГБ значительно снизилась благодаря внедрению универсального скрининга на СГБ на поздних сроках беременности и последующей интранатальной антибиотикопрофилактики (ВПБ) у женщин, инфицированных СГБ.

Последние данные свидетельствуют о том, что использование антибиотиков в раннем возрасте может изменить комменсальную микробиоту кишечника, тем самым нарушив баланс между здоровьем и болезнью в более позднем возрасте. Влияние IAP на бактериальную колонизацию кишечника младенцев в значительной степени не исследовано. Более того, имеющиеся в настоящее время данные по этому вопросу в значительной степени получены из исследований, проведенных с использованием культуральных методов; однако на точные результаты, основанные на культуре, влияет выбор правильной среды, температуры, содержания кислорода и времени для роста, и по этой причине легко культивируется всего 10–50% всех кишечных бактерий. Молекулярные методы, основанные на амплификации гена 16S рибосомной бактериальной РНК для дифференциации прокариотических таксонов, недавно были разработаны для изучения микробиоты кишечника, что позволяет более детально характеризовать бактериальные сообщества, чем стандартная культура.

Ранее мы оценили влияние ВБД на относительно небольшой выборке доношенных детей, находящихся на исключительно грудном вскармливании, родоразрешенных естественным путем, с помощью молекулярных методов; на 7-е сутки жизни было выявлено несколько различий в составе микробиоты между младенцами, подвергавшимися воздействию ИАП, и не подвергавшимися воздействию.

Таким образом, цель настоящей статьи состоит в том, чтобы более детально оценить эти различия, расширив исходную выборку и проследив за младенцами до месячного возраста. Также исследуется влияние типа питания на состав микробиоты.

В исследование включаются здоровые доношенные дети, рожденные естественным путем, с массой тела при рождении, соответствующей гестационному возрасту, матери которых прошли скрининг на СГБ на 35-37 неделе беременности.

Младенцы исключены, если:

• недоношенный или маленький/большой для гестационного возраста
• родила путем кесарева сечения
• мать получала какой-либо антибиотик за 4 недели до родов;
• материнский IAP выполняется по причинам, отличным от GBS-позитивности (т.е. длительный разрыв плодных оболочек у женщин с отрицательным статусом GBS);
• материнское ВБД неадекватно;
• материнский IAP проводится с антибиотиками, отличными от ампициллина, такими как эритромицин;
• у младенца серьезные врожденные пороки развития;
• у младенца появились признаки инфекции и/или он получал какое-либо лечение антибиотиками после рождения;
• наличие у младенца каких-либо серьезных клинических состояний, противопоказывающих его/ее участие в исследовании.

Младенцы распределяются на две группы в зависимости от материнского статуса GBS и IAP:

• Группа ВБД: дети, рожденные от СГБ-положительных матерей, получивших адекватное ВБД. В соответствии с Институциональным протоколом лечения для профилактики СГБ (полученным из рекомендаций CDC) ампициллин вводится внутривенно каждые 4 часа до родов (первая доза 2 г, последующие дозы по 1 г каждая). ВБД считается адекватным, если мать получила не менее двух доз ампициллина до родов.
• Контрольная группа: дети, рожденные от СГБ-негативных матерей, не получавших антибиотикотерапию до/во время родов.

Письменное информированное согласие получается у каждого родителя/законного опекуна младенца перед выпиской младенца из яслей (48-72 часа жизни). Характеристики пациентов, в том числе гестационный возраст, масса тела при рождении, пол и оценка по шкале Апгар через 1 и 5 минут после рождения, обобщаются в форме отчета о конкретном случае.

Во время контрольных посещений на 7-й и 30-й день жизни берут по два образца фекалий от каждого младенца. При каждом посещении информация о прибавке в весе, клинических состояниях, кормлении и проводимом лечении (т. использование пребиотиков, пробиотиков, антибиотиков), собирают у родителей младенцев.

После сбора образцы фекалий помещают в пронумерованные стерильные пластиковые контейнеры с завинчивающимися крышками и сразу же замораживают при температуре -80 °C до тех пор, пока они не будут обработаны для выделения бактериальной ДНК.

Микробиологические анализы выполняются на кафедре сельскохозяйственных наук Болонского университета. Исследователи, которые проводят анализы, слепы к групповой идентичности младенцев (IAP или контрольная группа).

Двести миллиграммов фекалий используют для выделения бактериальной ДНК с использованием мини-набора QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, West Sussex, UK). Экстрагированная ДНК хранится при температуре -80 °C. Чистоту и концентрацию выделенной ДНК определяют путем измерения отношения оптической плотности при 260 и 280 нм (Infinite® 200 PRO NanoQuant, Tecan, Маннедорф, Швейцария).

Количественное определение выбранных микробных групп (Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Bacteroides fragilis) проводят с помощью ПЦР в реальном времени. Данные, полученные в результате амплификации, преобразуют для получения количества бактериальных клеток на грамм фекалий, выраженного в виде логарифмических колониеобразующих единиц (КОЕ)/г.

Полученные данные анализируют с помощью IBM SPSS Statistic версии 20.0.0 (IBM Corporation, IBM Corporation Armonk, Нью-Йорк, США). Исходные характеристики в IAP и контрольных группах сравниваются с использованием U-критерия Манна-Уитни для независимых выборок для непрерывных переменных и критерия хи-квадрат для категориальных переменных. Влияние ВБД на количество бактерий в фекалиях на 7-й и 30-й день жизни оценивают с помощью U-критерия Манна-Уитни для независимых образцов. Иерархический множественный регрессионный анализ проводится для оценки влияния ВБД на количество фекальных бактерий после учета типа вскармливания младенцев (закодированного как бинарная категориальная переменная: исключительно грудное вскармливание по сравнению с любым кормлением смесью). Значение p