Effetto della profilassi antibiotica intrapartum (IAP) sullo sviluppo del microbiota intestinale neonatale. (MICROBIOTA-SO)

Alla nascita, il tratto gastro-intestinale (GI) neonatale viene rapidamente colonizzato da batteri materni e ambientali; i primi colonizzatori sono generalmente aerobi e anaerobi facoltativi, seguiti da anaerobi stretti (es. Bifidobacterium spp., Bacteroides spp. e Clostridium spp.). La composizione del microbiota intestinale è influenzata da diversi fattori, come la modalità del parto, l'età gestazionale, il microbiota intestinale e vaginale materno, il tipo di alimentazione, l'ospedalizzazione dopo la nascita e l'uso di antibiotici e probiotici.

Il microbiota intestinale dei neonati a termine, nati per via vaginale e allattati esclusivamente al seno, è considerato idealmente sano, con una bassa conta di C. difficile ed E. coli e un alto numero di Bidifobatteri e Lattobacilli, che influenzano positivamente la salute dell'ospite attivando cellule immunocompetenti nel tratto gastrointestinale, promuovendo la produzione di IgA secretorie e aumentando l'attività battericida dei neutrofili e l'immunità cellulo-mediata come l'attività delle cellule NK.

Lo streptococco di gruppo B (GBS) è una delle cause più importanti di infezioni neonatali e sepsi. I neonati nati per via vaginale possono acquisire GBS durante il processo di nascita dalla vagina materna, dalla cervice o dal retto, dove risiede in circa il 10-20% delle donne in gravidanza. Dalla metà degli anni '90, l'incidenza della sepsi da GBS ad esordio precoce è significativamente ridotta, a causa dell'introduzione dello screening universale per GBS durante la gravidanza avanzata e della conseguente profilassi antibiotica intrapartum (IAP) nelle donne positive al GBS.

Dati recenti suggeriscono che l'uso di antibiotici nei primi anni di vita potrebbe alterare il microbiota intestinale commensale, compromettendo così l'equilibrio tra salute e malattia più avanti nella vita. L'effetto della IAP sulla colonizzazione batterica dell'intestino del neonato non è stato ampiamente studiato. Inoltre, i dati attualmente disponibili su questo tema derivano in gran parte da studi effettuati utilizzando tecniche basate sulla cultura; tuttavia, i risultati accurati basati sulla coltura sono influenzati dalla selezione del terreno, della temperatura, del contenuto di ossigeno e del tempo di crescita corretti, e per questo motivo solo il 10-50% dell'intero batterio intestinale può essere facilmente coltivato. Tecniche molecolari, basate sull'amplificazione del gene dell'RNA batterico ribosomiale 16S per differenziare i taxa procarioti, sono state recentemente sviluppate per lo studio del microbiota intestinale, consentendo così una caratterizzazione più dettagliata delle comunità batteriche rispetto alla coltura standard.

Abbiamo precedentemente valutato l'effetto della IAP in un campione relativamente piccolo di neonati a termine allattati esclusivamente al seno, partoriti per via vaginale mediante tecniche molecolari; a 7 giorni di vita c'erano diverse differenze nella composizione del microbiota tra neonati esposti a IAP e non esposti.

Lo scopo del presente lavoro è quindi quello di valutare queste differenze in maggiore dettaglio, ampliando il campione iniziale e seguendo i bambini fino a un mese di età. Vengono anche esplorate le influenze del tipo di alimentazione sulla composizione del microbiota.

Sono stati arruolati nello studio neonati a termine sani, partoriti per via vaginale, con peso alla nascita adeguato all'età gestazionale e le cui madri erano state sottoposte a screening per GBS a 35-37 settimane di gestazione.

I neonati sono esclusi se:

• pretermine o piccolo/grande per l'età gestazionale
• nati con taglio cesareo
• la madre ha ricevuto qualsiasi antibiotico nelle 4 settimane prima del parto;
• la IAP materna viene eseguita per motivi diversi dalla positività al GBS (es. rottura prolungata delle membrane nelle donne GBS-negative);
• la IAP materna è inadeguata;
• la IAP materna viene eseguita con antibiotici diversi dall'ampicillina, come l'eritromicina;
• il bambino ha gravi malformazioni congenite;
• il bambino sviluppa segni di infezione e/o ha ricevuto un trattamento antibiotico dopo la nascita;
• il bambino presenta condizioni cliniche gravi che hanno controindicato la sua partecipazione allo studio.

I neonati sono assegnati in due gruppi in base allo stato GBS materno e IAP:

• Gruppo IAP: bambini nati da madri GBS positive che hanno ricevuto un'adeguata IAP. Secondo il protocollo di trattamento istituzionale per la profilassi da GBS (derivato dalle linee guida CDC), l'ampicillina iv viene somministrata ogni 4 ore fino al parto (prima dose 2 g, dosi successive 1 g ciascuna). La IAP è considerata adeguata se la madre ha ricevuto almeno due dosi di ampicillina prima del parto.
• Gruppo di controllo: bambini nati da madri GBS-negative, che non ricevono alcun trattamento antibiotico prima/al momento del parto.

Il consenso informato scritto viene ottenuto dal genitore/tutore legale di ogni bambino quando il bambino sta per essere dimesso dal nido (48-72 ore di vita). Le caratteristiche dei pazienti, tra cui l'età gestazionale, il peso alla nascita, il sesso e il punteggio di Apgar a 1' e 5' dopo la nascita, sono riassunte in uno specifico case report form.

Due campioni fecali di ciascun bambino vengono raccolti durante le visite di follow-up a 7 e 30 giorni di vita. Ad ogni visita, informazioni su aumento di peso, condizioni cliniche, alimentazione e trattamenti in corso (es. uso di prebiotici, probiotici, antibiotici), vengono raccolti presso i genitori dei neonati.

Dopo la raccolta, i campioni fecali vengono inseriti in contenitori di plastica sterili con tappo a vite numerati e immediatamente congelati a -80 °C, fino a quando non vengono processati per l'estrazione del DNA batterico.

Le analisi microbiologiche vengono eseguite presso il Dipartimento di Scienze Agrarie dell'Università di Bologna. Gli investigatori che eseguono le analisi sono ciechi rispetto all'identità di gruppo dei bambini (IAP o gruppo di controllo).

Duecento milligrammi di feci vengono utilizzati per l'estrazione del DNA batterico utilizzando il kit QIAamp DNA Stool Mini (QIAGEN, West Sussex, Regno Unito). Il DNA estratto viene conservato a -80 °C. La purezza e la concentrazione del DNA estratto sono determinate misurando il rapporto dell'assorbanza a 260 e 280 nm (Infinite® 200 PRO NanoQuant, Tecan, Mannedorf, Svizzera).

La quantificazione di gruppi microbici selezionati (Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Bacteroides fragilis) viene eseguita con PCR in tempo reale. I dati ottenuti dall'amplificazione vengono trasformati per ottenere il numero di cellule batteriche per grammo di feci, espresso come unità formante colonie (CFU)/g.

I dati ottenuti vengono analizzati utilizzando IBM SPSS Statistic versione 20.0.0 (IBM Corporation, IBM Corporation Armonk, New York, Stati Uniti). Le caratteristiche di base nei gruppi IAP e di controllo vengono confrontate utilizzando il test U di Mann-Whitney per campioni indipendenti per le variabili continue e il test chi-quadrato per le variabili categoriche. L'influenza della IAP sulla conta batterica fecale a 7 e 30 giorni di vita viene valutata utilizzando il test U di Mann-Whitney per campioni indipendenti. Viene eseguita un'analisi di regressione multipla gerarchica per stimare l'effetto della IAP sulla conta batterica fecale dopo aver controllato il tipo di alimentazione infantile (codificata come variabile categorica binaria: allattamento al seno esclusivo rispetto a qualsiasi alimentazione artificiale). Un valore p