Efeito da profilaxia antibiótica intraparto (IAP) no desenvolvimento da microbiota intestinal neonatal. (MICROBIOTA-SO)

Ao nascimento, o trato gastrointestinal (GI) neonatal é rapidamente colonizado por bactérias maternas e ambientais; os primeiros colonizadores são geralmente aeróbios e anaeróbios facultativos, seguidos por anaeróbios estritos (p. Bifidobacterium spp., Bacteroides spp. e Clostridium spp.). A composição da microbiota intestinal é influenciada por diversos fatores, como tipo de parto, idade gestacional, microbiota intestinal e vaginal materna, tipo de alimentação, internação após o parto e uso de antibióticos e probióticos.

A microbiota intestinal de bebês nascidos a termo, nascidos por via vaginal e amamentados exclusivamente, é considerada idealmente saudável, com baixa contagem de C. difficile e E. coli e alto número de Bidifobacteria e Lactobacilli, que influenciam positivamente a saúde do hospedeiro ativando células imunocompetentes no trato GI, promovendo a produção de IgA secretora e aumentando a atividade bactericida dos neutrófilos e a imunidade mediada por células, como a atividade das células NK.

O estreptococo do grupo B (GBS) é uma das causas mais importantes de infecções neonatais e sepse. Bebês nascidos de parto vaginal podem adquirir GBS durante o processo de nascimento da vagina, colo do útero ou reto materno, onde reside em aproximadamente 10-20% das mulheres grávidas. Desde meados dos anos 90, a incidência de sepse por GBS de início precoce é significativamente reduzida, devido à introdução da triagem universal de GBS durante a gravidez tardia e consequente profilaxia antibiótica intraparto (IAP) em mulheres GBS-positivas.

Dados recentes sugerem que o uso de antibióticos no início da vida pode alterar a microbiota intestinal comensal, prejudicando assim o equilíbrio entre saúde e doença mais tarde na vida. O efeito do IAP na colonização bacteriana do intestino do bebê não foi amplamente investigado. Além disso, os dados atualmente disponíveis sobre esse assunto derivam em grande parte de estudos realizados com técnicas baseadas em cultura; no entanto, resultados precisos baseados em cultura são influenciados pela seleção do meio correto, temperatura, conteúdo de oxigênio e tempo de crescimento e, por esse motivo, apenas 10-50% de todas as bactérias intestinais são facilmente cultivadas. Técnicas moleculares, baseadas na amplificação do gene do RNA bacteriano ribossômico 16S para diferenciar táxons procarióticos, foram recentemente desenvolvidas para o estudo da microbiota intestinal, permitindo assim uma caracterização mais detalhada das comunidades bacterianas do que a cultura padrão.

Anteriormente, avaliamos o efeito do IAP em uma amostra relativamente pequena de bebês nascidos a termo alimentados exclusivamente com leite materno por meio de técnicas moleculares; aos 7 dias de vida, houve várias diferenças na composição da microbiota entre bebês expostos e não expostos ao IAP.

O objetivo do presente trabalho é, portanto, avaliar mais detalhadamente essas diferenças, ampliando a amostra inicial e acompanhando os lactentes até um mês de idade. As influências do tipo de alimentação na composição da microbiota também são exploradas.

Bebês nascidos a termo saudáveis, nascidos de parto vaginal, com peso ao nascer adequado para a idade gestacional, e cujas mães foram rastreadas para GBS em 35-37 semanas de gestação, são incluídos no estudo.

Bebês são excluídos se:

• prematuro ou pequeno/grande para a idade gestacional
• nascido de cesariana
• a mãe recebeu algum antibiótico nas 4 semanas anteriores ao parto;
• A IAP materna é realizada por outros motivos que não a positividade do GBS (ou seja, ruptura prolongada de membranas em mulheres GBS-negativas);
• PIA materna é inadequada;
• A IAP materna é realizada com outros antibióticos além da ampicilina, como a eritromicina;
• a criança tem grandes malformações congênitas;
• a criança desenvolve sinais de infecção e/ou recebeu algum tratamento antibiótico após o nascimento;
• o lactente apresentar alguma condição clínica grave que contraindicasse sua participação no estudo.

Os bebês são alocados em dois grupos de acordo com o estado de GBS materno e IAP:

• Grupo IAP: bebês nascidos de mães GBS-positivas que receberam IAP adequado. De acordo com o protocolo de tratamento institucional para profilaxia de GBS (derivado das diretrizes do CDC), a ampicilina iv é administrada a cada 4 horas até o parto (primeira dose 2 g, doses seguintes 1 g cada). A PIA é considerada adequada se a mãe tiver recebido pelo menos duas doses de ampicilina antes do parto.
• Grupo controle: crianças nascidas de mães GBS negativas, que não recebem nenhum tratamento antibiótico antes/no momento do parto.

O consentimento informado por escrito é obtido dos pais/responsável legal de cada criança quando a criança está prestes a receber alta do berçário (48-72 horas de vida). As características dos pacientes, incluindo idade gestacional, peso ao nascer, sexo e pontuação de Apgar em 1' e 5' após o nascimento, são resumidas em um formulário de relato de caso específico.

Duas amostras fecais de cada criança são coletadas durante as visitas de acompanhamento aos 7 e 30 dias de vida. Em cada visita, informações sobre ganho de peso, condições clínicas, alimentação e tratamentos em andamento (ou seja, uso de prebióticos, probióticos, antibióticos), são coletados dos pais das crianças.

Após a coleta, as amostras fecais são colocadas em recipientes plásticos estéreis numerados com tampa de rosca e imediatamente congeladas a -80 °C, até serem processadas para extração de DNA bacteriano.

As análises microbiológicas são realizadas no Departamento de Ciências Agrícolas da Universidade de Bolonha. Os investigadores que realizam as análises são cegos para a identidade do grupo dos bebês (IAP ou grupo de controle).

Duzentos miligramas de fezes são usados ​​para extração de DNA bacteriano usando o QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, West Sussex, Reino Unido). O DNA extraído é armazenado a -80 °C. A pureza e a concentração do DNA extraído são determinadas medindo a razão da absorbância a 260 e 280 nm (Infinite® 200 PRO NanoQuant, Tecan, Mannedorf, Suíça).

A quantificação de grupos microbianos selecionados (Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Bacteroides fragilis) é realizada com PCR em tempo real. Os dados obtidos da amplificação são transformados para obter o número de células bacterianas por grama de fezes, expresso em log da unidade formadora de colônias (CFU)/g.

Os dados obtidos são analisados ​​usando o IBM SPSS Statistic versão 20.0.0 (IBM Corporation, IBM Corporation Armonk, Nova York, Estados Unidos). As características basais nos grupos IAP e controle são comparadas usando o teste U de Mann-Whitney de amostras independentes para variáveis ​​contínuas e o teste do qui-quadrado para variáveis ​​categóricas. A influência da PIA na contagem bacteriana fecal aos 7 e 30 dias de vida será avaliada por meio do teste U de Mann-Whitney para amostras independentes. Uma análise de regressão múltipla hierárquica é realizada para estimar o efeito do IAP na contagem bacteriana fecal após o controle do tipo de alimentação infantil (codificada como uma variável categórica binária: amamentação exclusiva versus qualquer alimentação com fórmula). Um valor p