Vliv intrapartální antibiotické profylaxe (IAP) na vývoj novorozenecké střevní mikroflóry. (MICROBIOTA-SO)

Při narození je neonatální gastrointestinální (GI) trakt rychle kolonizován mateřskými a environmentálními bakteriemi; prvními kolonizátory jsou obecně aerobové a fakultativní anaeroby, po nich následují striktní anaeroby (např. Bifidobacterium spp., Bacteroides spp. a Clostridium spp.). Složení střevní mikroflóry je ovlivněno několika faktory, jako je způsob porodu, gestační věk, mateřská střevní a vaginální mikrobiota, typ výživy, hospitalizace po porodu a užívání antibiotik a probiotik.

Střevní mikroflóra nedonošených dětí, vaginálně porozených a výhradně kojených, je považována za ideálně zdravou, s nízkým počtem C. difficile a E. coli a vysokým počtem Bidifobakterií a laktobacilů, které pozitivně ovlivňují zdraví hostitele aktivací imunokompetentních buněk. v GI traktu, podporuje produkci sekrečního IgA a zvyšuje baktericidní aktivitu neutrofilů a buněčně zprostředkovanou imunitu, jako je aktivita NK buněk.

Streptococcus skupiny B (GBS) je jednou z nejdůležitějších příčin neonatálních infekcí a sepse. Vaginálně porozené děti mohou získat GBS během porodního procesu z pochvy matky, děložního čípku nebo konečníku, kde se vyskytuje u přibližně 10–20 % těhotných žen. Od poloviny 90. let je výskyt časné GBS sepse významně snížen díky zavedení GBS univerzálního screeningu v pozdním těhotenství a následné intrapartální antibiotické profylaxi (IAP) u GBS-pozitivních žen.

Nedávné údaje naznačují, že užívání antibiotik v raném věku by mohlo změnit komenzální střevní mikroflóru, a tím narušit rovnováhu mezi zdravím a nemocí v pozdějším věku. Vliv IAP na bakteriální kolonizaci střeva kojence nebyl do značné míry zkoumán. V současnosti dostupné údaje o této problematice navíc pocházejí z velké části ze studií provedených za použití technik založených na kultuře; přesné výsledky založené na kultivaci jsou však ovlivněny výběrem správného média, teplotou, obsahem kyslíku a dobou růstu, az tohoto důvodu lze snadno kultivovat pouze 10–50 % všech střevních bakterií. Pro studium střevní mikroflóry byly nedávno vyvinuty molekulární techniky založené na amplifikaci 16S ribozomálního bakteriálního genu RNA k diferenciaci prokaryotických taxonů, což umožňuje podrobnější charakterizaci bakteriálních společenstev než standardní kultivace.

Již dříve jsme hodnotili účinek IAP na relativně malém vzorku výhradně kojených dětí v termínu porodu vaginálně pomocí molekulárních technik; v 7 dnech života bylo několik rozdílů ve složení mikrobioty mezi kojenci vystavenými IAP a neexponovanými.

Cílem této práce je tedy tyto rozdíly podrobněji vyhodnotit, rozšířit výchozí vzorek a sledovat kojence do jednoho měsíce věku. Zkoumány jsou také vlivy typu krmení na složení mikrobioty.

Do studie jsou zahrnuti zdraví donošení novorozenci, porození vaginálně, s porodní hmotností přiměřenou gestačnímu věku a jejichž matky byly vyšetřeny na GBS ve 35. až 37. týdnu těhotenství.

Kojenci jsou vyloučeni, pokud:

• předčasné nebo malé/velké na gestační věk
• narozený císařským řezem
• matka dostala jakékoli antibiotikum během 4 týdnů před porodem;
• mateřská IAP se provádí z jiných důvodů, než je GBS pozitivita (tj. prodloužená ruptura membrán u GBS-negativních žen);
• mateřská IAP je nedostatečná;
• mateřská IAP se provádí s antibiotiky jinými než ampicilin, jako je erythromycin;
• dítě má velké vrozené vady;
• u kojence se po narození rozvinou známky infekce a/nebo podstoupilo jakoukoli antibiotickou léčbu;
• dítě má jakékoli závažné klinické stavy, které kontraindikovaly jeho/její účast ve studii.

Kojenci jsou rozděleni do dvou skupin podle stavu GBS matky a IAP:

• Skupina IAP: děti narozené GBS-pozitivním matkám, které dostaly adekvátní IAP. Podle institucionálního léčebného protokolu pro profylaxi GBS (odvozeného z doporučení CDC) se iv ampicilin podává každé 4 hodiny až do porodu (první dávka 2 g, následující dávky každá 1 g). IAP se považuje za adekvátní, pokud matka před porodem dostala alespoň dvě dávky ampicilinu.
• Kontrolní skupina: děti narozené GBS-negativním matkám, které nedostávají žádnou antibiotickou léčbu před/při porodu.

Písemný informovaný souhlas se získá od každého rodiče/zákonného zástupce dítěte, když má být dítě propuštěno z jeslí (48–72 hodin života). Charakteristiky pacientek, včetně gestačního věku, porodní hmotnosti, pohlaví a Apgar skóre v 1' a 5' po narození, jsou shrnuty ve formě specifické kazuistiky.

Od každého kojence se odebírají dva vzorky stolice během následných návštěv v 7. a 30. dni života. Při každé návštěvě informace o přírůstku hmotnosti, klinickém stavu, krmení a probíhající léčbě (tj. užívání prebiotik, probiotik, antibiotik), jsou shromažďovány od rodičů kojenců.

Po odběru se vzorky stolice vloží do očíslovaných sterilních plastových nádob se šroubovacím uzávěrem a ihned zmrazí na -80 °C, dokud nejsou zpracovány pro extrakci bakteriální DNA.

Mikrobiologické analýzy se provádějí na katedře zemědělských věd Univerzity v Bologni. Zkoušející, kteří provádějí analýzy, jsou slepí vůči skupinové identitě kojenců (IAP nebo kontrolní skupina).

Dvě stě miligramů stolice se používá k extrakci bakteriální DNA pomocí sady QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, West Sussex, UK). Extrahovaná DNA se skladuje při -80 °C. Čistota a koncentrace extrahované DNA se stanoví měřením poměru absorbance při 260 a 280 nm (Infinite® 200 PRO NanoQuant, Tecan, Mannedorf, Švýcarsko).

Kvantifikace vybraných mikrobiálních skupin (Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Bacteroides fragilis) se provádí pomocí PCR v reálném čase. Data získaná z amplifikace se transformují, aby se získal počet bakteriálních buněk na gram stolice, vyjádřený jako logaritmus jednotky tvořící kolonie (CFU)/g.

Získaná data jsou analyzována pomocí IBM SPSS Statistic verze 20.0.0 (IBM Corporation, IBM Corporation Armonk, New York, Spojené státy americké). Základní charakteristiky v IAP a kontrolních skupinách jsou porovnány pomocí Mann-Whitneyho U testu s nezávislými vzorky pro spojité proměnné a chí-kvadrát testu pro kategorické proměnné. Vliv IAP na počet bakterií ve stolici v 7. a 30. dni života bude hodnocen pomocí Mann-Whitney U testu s nezávislými vzorky. Hierarchická mnohonásobná regresní analýza se provádí za účelem odhadu účinku IAP na počet bakterií ve stolici po kontrole typu kojení (kódováno jako binární kategorická proměnná: výhradní kojení vs. jakákoli umělá výživa). Hodnota A p