Suoliston vastemallit mikrobisignaaleihin

Mukaan otetaan vain yli 18-vuotiaat aikuiset. Mukana on kaksi kohorttia: CD-potilaiden kohortti (mukaan lukien tietyt alakohortit tunnettujen ja uusien CD-potilaiden ja matkustavien CD-potilaiden sekä arkistoidut patologiset näytteet postoperatiivisesta CD-sairaudesta, yhteensä n= 300) ja kohortti kontrolleja (terveet yksilöt ja CD-potilaiden perheenjäsenet, yhteensä n = 200). Otamme CD-potilailta uloste- ja verinäytteitä ja suolistobiopsia- ja/tai resektionäytteitä sekä terveiltä henkilöiltä ja oireettoilta sukulaisilta, joille tehdään kolonoskopia tutkimukseen liittymättömistä syistä (esim. seulontakolonoskopia). ).

Ilmoitetun suostumuksen allekirjoittamisen jälkeen otetaan ulostenäyte ja verinäyte (20cc). Suolistoinfektiot suljetaan pois ulosteviljelmillä, loisilla, mukaan lukien entameba, ja C. difficile -määrityksellä. Tulehdusmarkkerit (CRP veressä, kalprotektiini ulosteessa) testataan. Verinäytteille suoritetaan immuunikarakterisointi, mukaan lukien in vitro -testaus immuunisoluaktivaatiolla, sytokiinierityksen mittaukset ja solun pintamarkkerianalyysi FACS:lla. Kaksi ulostenäytettä luovuttajaa kohti (≥ 3 g tai 3 ml kukin) kerätään puhtaisiin astioihin huoneenlämpötilassa, pakastetaan tuoreena -20 °C:ssa ja säilytetään sitten -80 °C:ssa 72 tunnin sisällä. Otamme myös kolonoskopiassa neljä biopsiaa tulehtuneesta ja tulehtumattomasta sykkyräsuolen ja paksusuolen limakalvosta (yhteensä 8 biopsiaa). Jokaiselta yksilöltä jaetaan näytteet Shebassa suoritettavia analyysejä ja siirtoa varten. Uloste siirretään professori Elinaville Weizmann-instituuttiin suorittamaan mikrobiomin haulikon metagenomiikka. Suoliston biopsia ja/tai arkistoidut resektionäytteet (histologia) siirretään professori Stappenbeckille Washingtonin yliopistoon, St. Louis, USA, synnynnäisten immuunisolujen histologista analyysiä ja paneth-solumorfologiaa H&E:n ja immunohistokemian avulla.

Ileaali- ja peräsuolen biopsiat kerätään ja säilytetään välittömästi RNAlaterissa. Biopsiat otetaan jokaisesta paikasta (joko tulehtunut tai ei tulehtunut, yhteensä 8 biopsiaa) ja niitä käytetään RNA:n ja mikrobien DNA:n uuttamiseen. RNA:ta käytetään kudoksen mRNAseq:iin ja DNA:ta mikrobien karakterisointiin. mRNAseq tehdään NIH:n tukeman ruoansulatuskanavan terveyskeskuksen (DHC) ytimessä Cincinnati Children Hospital Medical Centerissä (CCHMC), jossa yli 700 mRNAseq:tä eri IBD-kohorteista, mukaan lukien RISK CD- ja PROTECT UC -kohortteja, ajettiin jo hyvillä tuloksilla. Mikrobien 16S-amplikonin sekvensointi ulosteesta ja biopsiasta erotetusta DNA:sta tehdään edellä kuvatulla tavalla.

Molempien kohorttien potilaat käyvät läpi myös ympäristö- ja ruokavalioaltistustutkimuksen. Ympäristöaltistumiseen käytämme IBD:n kansainvälisen järjestön (IOIBD) kehittämää kyselylomaketta tietyin muutoksin. Kyselylomake koostuu 87 kysymyksestä, jotka kattavat 25 eri aihetta, joita ehdotetaan CD:n ja/tai UC:n ympäristöriskitekijöiksi. Tätä kyselylomaketta on käytetty aiemmin epidemiologisissa tutkimuksissa, joissa on selvitetty IBD:n laukaisevia tekijöitä, mukaan lukien Kaakkois-Aasiassa ja Kiinassa tehty tutkimus. Kysymykset liittyvät viiteen eri alueeseen: (i) Lapsuustekijät 20-vuotiaaksi asti, mukaan lukien imetys, umpilisäkkeen poisto, nielurisojen poisto, ekseema, rokotukset (tuberkuloosi, pertussis, tuhkarokko, vihurirokko, kurkkumätä, tetanus, polio), lapsuuden infektiot (tuhkarokko, hinkuyskä) , vihurirokko, vesirokko, sikotauti, tulirokko) ja lemmikkien omistus; ii) ruokailutottumukset, mukaan lukien hedelmien, vihannesten, kananmunien, murojen, leivän, murojen, kahvin, teen, mehun, sokerin ja pikaruoan päivittäinen, viikoittainen tai harvemmin nauttiminen; (iii) tupakointitottumukset (nykyinen tupakoitsija, tupakoimaton, entinen tupakoitsija); iv) hygieniaolosuhteet, kuten talon sisäisen vesihanan, kuumavesihanan tai huuhteluvessan saatavuus; ja (v) muut tekijät, mukaan lukien päivittäinen fyysinen aktiivisuus, suun kautta otettavat ehkäisytabletit ja stressaavat tapahtumat ennen diagnoosia. Lisäämme IOIBD-kyselyyn myös antibioottien käyttöä ennen 15 vuoden ikää ja sen jälkeen, hammastahnan käyttöä sekä amalgaamihampaiden täyttöä lapsuudessa tai myöhemmässä elämässä.

Ruokailutottumusten kartoittamiseen käytämme koulutetun ravitsemusterapeutin suorittamaa haastattelua validoitua strukturoitua FFQ:ta (Food Frequency Questionnaire) käyttäen. Tämä työkalu tallentaa yli 600 ruokaa, jotka priorisoidaan niiden ennalta määritetyn tiheyden mukaan tavallisessa ruokavaliossa. Henkilöstöä koulutetaan ruokavaliohaastattelumenetelmään. FFQ-tulokset tuodaan edelleen tietokoneistettuun FFQ-versioon, joka automaattisesti johtaa ja normalisoi ravintoainepitoisuuden yksittäisen potilaan ruokavaliosta kansallisen tilastoinstituutin tunnetun Israelin ruoka-erien ravintoainetietokannan perusteella. Kuten tämän esimerkillisen potilaan responsiivisen ohjelmiston kuvakaappauskuvassa näkyy, jokainen väripalkki ilmaisee yksilön tiettyä ravintoaineiden kulutusta (esim. proteiinia, oligosakkarideja jne.) sekä sen eroa WHO:n normalisoidusta kulutuksesta (vihreä värialue). . FFQ-metodologiaa täydennetään mahdollisella kolmen päivän ruokavalioreitin validoinnilla SmartPhonella. Osallistujat ottavat sähköisiä kuvia kaikista näiden kolmen päivän aikana nautituista ruoista. Valokuvat ladataan sähköiseen visuaaliseen tietokantaan, ja ruokatuotteet tunnistetaan, tallennetaan ja tarkistetaan retrospektiivisen FFQ:n perusteella.

Priorisoidaksemme useiden ympäristö-/ruokavaliotekijöiden joukossa teemme järjestelmällisen katsauksen ja meta-analyysin kaikista CD:n ympäristöriskitekijöitä koskevista julkaisuista. Laskemme kullekin muuttujalle yhdistetyn kerroinsuhteen ja pisteestimaatit ja määritämme muuttujien väliset painotetut vaikutukset satunnaisvaikutusmallilla. Tämä mahdollistaa sellaisten tekijöiden erittelyn ja tunnistamisen, joiden on todettu parhaiten ja vahvimmin liittyvän CD:n esiintymiseen. Priorisoimme sitten nämä muuttujat vaiheittain analysoidaksemme ympäristötekijöitä, jotka liittyvät mikrobiomi-, transkriptio- ja PCP-häiriöihin.